Many nanomaterials were recently incorporated into development of vaccines due to their advantages in kinetics of antigen exposure and cellular processing. While physicochemical properties of nanomaterials might be determining factors in the induction of immune response, their ultimate influence on the immune response has not been definitively established and rational vaccine design is challenging.
In second chapter, we studied the effect of gold nanoparticle size on lymph node delivery and induction of CD8+ T-cell response. Specifically, immune responses to sub-40nm gold nanoparticles (GNPs) which can directly drain into lymph nodes were assessed. To study the size effect of GNPs on cellular immune response, GNPs with diameters of 7, 14, 28 nm were successfully conjugated with recombinant ovalbumin, resulting in OVA-GNPs with hydrodynamic diameter (HD) of ~10, 22, and 33 nm. DC cell uptake and cross-presentation efficiency in vitro was increased in size-dependently, and lymph node delivery of OVA-GNPs in vivo was higher in 22 and 33-nm of OVA-GNPs compared to 10 nm OVA-GNPs. An ex vivo restimulation assay using OVA as an antigen revealed that OVA-GNP (22, 33 nm) immunized groups had higher frequencies of OVA-specific CD8+ T cells; moreover, these cells were shown to be poly-functional. 22-nm OVA-GNPs showed greater antitumor efficacy, and higher infiltration of CD8+ T-cells and greater tumor cell apoptosis and cell death than 10-nm OVA-GNPs. Taken together, our results suggest that the size threshold for induction of potent cellular responses and T-cell poly-functionality by GNPs lies between 10 nm and 22 nm, and highlight the importance of nanoparticle size as a critical parameter in designing and developing nanoparticle-based vaccines.
In third chapter, we studied the effect of GNP surface chemistry on T-cell cross-priming by dendritic cells. Specifically, we constructed a library of peptide-gold nanoparticle-antigen hybrids system with tunable surface chemistry by decorating the surface of 14 nm GNPs with OVA antigens and various peptide ligands. Most of synthesized hybrids were physiologically stable and efficiently taken up by dendritic cells. Through screening of a library of peptide-gold nanoparticle-antigen hybrids using DC2.4 cells and OT-1 T-cells, we could identify the heat hybrids with maximized cross-priming efficiency. Also, hybrids nanoparticles coated with peptides ending with amino acids containing carboxyl or hydroxyl side chain induced higher level of cross-priming than those containing hydrophobic and aromatic ring. Those heat hybrids indeed more efficiently primed BMDCs to induce higher level of OT-1 T-cell proliferation. These results showed the usefulness of our screening methods and the potential of heat hybrids to be used as antigen-pulsing agents for development of dendritic cell-based vaccine. This work also highlights the importance of nanoparticle surface chemistry in T-cell cross-priming process, and informs the principle for designing of antigen-pulsing agents for DC priming.
최근 들어 나노입자를 기반으로한 항암백신 개발이 많은 관심을 받고 있다. 하지만, 항암면역반응에 있어서 중요한 세포성 면역반응을 효과적으로 유도 할 수 있는 나노입자 백신의 임계 크기 및 표현화학에 대해서는 면밀히 연구된 바가 없다.
2장에서는 금나노입자 기반 백신의 크기가 림프절에 전달에 미치는 영향 및 CD8+ T 세포반응에 미치는 영향에 대한 분석을 수행함으로써, 효과적인 금나노입자 기반 항암백신 개발을 위한 임계 크기를 제시하려고 하였다. 이를 위해, 7, 14, 28 nm 크기의 금나노 입자에 모델 단백질인 난알부민을 접합시켜, 크기가 다른 세가지 금나노입자 백신을 합성하였다. 합성된 금나노백신은 수분산크기가 각각 ~10, 22, 33 nm 로 확인되었으며, in vitro 실험에서 나노입자 크기가 증가 함에 따라 수지상세포에 의한 탐식, 수지상세포의 활성화 및 T 세포 교차자극이 증가하는 것으로 확인되었다. 마우스 실험시, 22, 33 nm 크기의 금나노입자 백신은 10 nm 크기의 백신에 비해 더 높은 림프절 전달 효율을 보였으며, 항원특이적 CD8+ T 세포 반응을 더 효과적으로 유도하였다. 특히, 다기능성 CD8+ T 세포 반응이 더 효과적으로 유도되는 것으로 확인되었다. 또한 마우스 암모델을 이용한 실험시, 22 nm 크기의 금나노입자 백신이 10 nm 크기의 백신에 비해 더 높은 항암효과를 나타냈으며, CD8+ T 세포의 암조직 침투 및 암세포 사멸 수준 또한 더 높은 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 통해, 본 연구는 효과적인 세포성 면역반응과 T세포 다기능성을 유발 할 수 있는 금나노입자 백신의 임계크기가 10~22nm 사이에 있음을 제시하였으며, 나노입자를 기반으로한 백신 개발에 있어서 크기의 중요성을 강조하였다.
3장에서는 금나노입자의 표면화학이 수지상세포에 의한 T 세포의 교차자극에 미치는 영향에 대해 분석하였다. 14 nm 크기의 금나노입자 표면에 난알부민 항원과 다양한 종류의 펩타이드 리간드를 도입함으로써, 표면화학의 조절이 용이한 펩타이드-금나노입자-항원 하이브리드로 구성된 나노입자 라이브러리를 구축하였다. 합성된 대부분의 하이브리드 나노입자는 생리학적인 조건에서 안정하였으며, 수지상세포 내로 효과적으로 유입되었다. DC 2.4 수지상세포와 OT-1 T 세포를 이용한 스크리닝 결과, 효과적인 T 세포 교차자극을 유도할 수 있는 후보 하이브리드 입자를 찾아낼 수 있었다. 또한 카르복실기나 하이드록실 잔기를 가지고 있는 아미노산으로 표면이 코팅된 하이브리드 금나노입자가 수소성 또는 방향족 잔기를 가지고 있는 아미노산으로 코팅된 금나노입자에 비해, 좀 더 효과적으로 T 세포 교차자극을 유도하는 것으로 나타났다. 나아가 선택된 후보 하이브리드 금나노입자는 마우스 골수 유래 수지상 세포를 효과적으로 자극시켜, T 세포의 분열을 더 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해, 본 스크리닝 기법의 유용성을 확인할 수 있었으며, 선택된 후보 하이브리드 금나노입자가 수지상세포 기반 백신의 개발에 있어서 효과적인 항원감작제로 사용될 수 있는 가능성을 확인 할 수 있었다. 나아가, 나노입자를 기반으로 한 항원감작제 개발에 있어서 표현화학의 중요성을 강조하였다.
