Producing functional recombinant proteins in soluble form is a difficult-to-comprehend frontier in engineering bacterial hosts. Although a majority of recombinant proteins are amenable as substrates for the natural molecular chaperone-mediated solubilisation, due to limited availability of molecular chaperones in cells, not all recombinant proteins have the chance to be solubilized. In this study, the effect of spatial constraint between molecular chaperones of DnaK chaperone system in Escherichia coli with the translation system producing a protein of interest was evaluated. In order to achieve the spatial constraint of molecular chaperones and their substrates, two systems, namely chaperone recruiting mRNA scaffold (CRAS) and chaperone-substrate co-localized expression (CLEX) system were developed. In CRAS system, E. coli chaperone DnaJ is anchored to 3’ untranslated region of an mRNA encoding a target protein via fusion to KH, an RNA binding domain. While in CLEX system, the translation of target proteins are coupled with that of DnaJ using overlapping stop-start codon 5’-TAATG-3’. Significant solubility enhancement of selected aggregation-prone recombinant proteins, up to 95%, was observed in the application of both systems. The success of using the systems emphasizes the importance of coupling the translation and refolding processes in a spatial constrained manner.
원핵세포주를 이용한 재조합단백질의 생산에 있어서 단백질의 잘못된 접힘과 응집은 가장 일반적이면서 어려운 문제이다. 내포체의 형성을 감소시키기 위해 분자 샤페론의 사용을 포함한 다양한 시도들이 연구되고 있지만, 특정 단백질의 용해성을 높여주는 데에만 효과적이다. 본 연구에서는 목적 단백질을 생산하는 대장균의 번역시스템에서 공간적으로 제약된 DnaJK의 샤페론 시스템의 효과를 확인하였다. 샤페론을 공간적으로 제약하기 위해 Chaperone Recruiting mRNA Scaffold (CRAS)와 Chaperone-substrate co-localized Expression (CLEX)라고 명명한 두 가지 시스템을 개발되었고, 잘못 접히거나 응집되기 쉬운 다양한 재조합단백질들의 용해성을 증가시켜서 과발현하는데 성공적으로 적용되었다. CRAS 시스템에서 대장균 샤페론인 DnaJ는 RNA 결합 도메인인 KH를 통해 목적 단백질을 코딩하는 mRNA의 3’비 번역 지역 부분에 고정된다.CLEX 시스템에서 DnaJ는 목적단백질과 각각 반복적인 정지-개시 코돈을 가지고 가깝게 발현된다.CRAS 와 CLEX system을 이용할 경우, 생산되는 전체 단백질의 95%까지 단백질의 용해성이 증가된 형태로 발현될 수 있다. 단순히 DnaJ나 DnaK를 동시 발현시켰을 때 타겟 단백질 중에서 주목할만한 용해성이 관찰되지 않았기 때문에, 이 시스템 사용의 성공은 공간적으로 제약된 방식에서 번역과 재접힘과정의 필수적으로 연결되어야 하는 것을 강조한다. 더 나아가, 본 연구는 in vivo 상에서 DnaK에 독립적인 DnaJ의 foldase 활성과 DnaJ와 DnaK의 키메라 결합이 샤페론 활성을 현저히 증가시키는 것을 시사한다
