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Study of synaptic vesicles for membrane fusion and extracellular vesicles for cell signaling using single-molecule imaging technique = 단분자 측정기술을 이용한 세포 외 소포체들의 세포 내 신호전달과 단백질 복합체의 생체막 융합 기작에 관한 연구
서명 / 저자 Study of synaptic vesicles for membrane fusion and extracellular vesicles for cell signaling using single-molecule imaging technique = 단분자 측정기술을 이용한 세포 외 소포체들의 세포 내 신호전달과 단백질 복합체의 생체막 융합 기작에 관한 연구 / Mi Sook Sung.
저자명 Sung, Mi Sook ; 성미숙
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2017].
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Vesicle transport is very crucial mechanism which occurs in every cells mediating many biological events and by which cells communicate each other and then maintain physiology and homeostasis. However, sometimes oncogenic cells also transfer abnormal signals by emitting ‘extracellular vesicles (EVs)’ which, therefore, are recently emerging therapeutic opportunities. Here, we ask how distinct types of EVs differently represent their parental cells from an oncoprotein-delivery perspective. By measuring protein-protein interactions (PPIs) between EGFR and representative downstream effector proteins (called “probes”) in EVs produced by NSCLC cells, we test which type of EVs better represents the status of its cell of origin. While the phosphotyrosine level on EGFR in EVs has been investigated and others observed the activation of signaling proteins downstream of EGFR, direct measurement of PPIs between signaling proteins from EVs has not been reported so far. Our data show that microvesicles closely reflect the cellular EGFR in their downstream signaling potential while exosomes generally display upregulated PPIs. Using drug-resistant cells and EVs derived from them, we also study how EVs adjust their PPI landscape when it has drug resistance. Ultimately, we hope EVs thus characterized could be utilized in clinical diagnosis and prognosis with clearer understanding of their implications: microvesicles as reflectors of parent cells and exosomes as predictors of drug sensitivity. Another important vesicle trafficking is synaptic vesicle fusion, which deals with neurotransmitter release in synapse, at the end of neuron. It has been known that intracellular Ca regulates transmitter release, and synaptotagmin is its regulator, that was observed direct control of $Ca^{2+}$ concentration at a large terminal, in vivo experiments. However, a mechanism of the fusion has not been fully understood and contribution of syt to the membrane fusion is also controversial whether fusogen or not. Therefore, many in vitro studies have been struggling to mimic fast $Ca^{2+}$-triggered fusion, but there still is a room for a reliable and conserved result. By developing ability to detect content mixing in single vesicle fusion events, we here show that such dynamic $Ca^{2+}$-dependent Syt1 activity is also observed at the content mixing level, not only lipid mixing. Deactivation of SNAREs interferes stimulation of syt so that we infer its role of $Ca^{2+}$ regulator operates only when SNAREs are active as a fusion machinery.

이 논문에서는 전반사 현미경을 이용한 다양한 소포체들의 기작에 관한 연구를 다루었다. 소포체 운송 과정은 세포 간 또는 세포 내 신호 전달에 중요한 역할을 하고 자주, 반복적으로 일어나는 기작이다. 따라서 각각의 소포체의 기작을 밝혀내는 것이 생명 현상을 이해하고 나아가 몸을 치료하는 데 유익한 정보를 제공하는 중요한 일이다. 첫 번째로 다룬 세포 외 소포체는 생성기전에 따라 크게 마이크로베시클과 엑소좀, 두 종류로 나눌 수 있다. 정상 세포에서도 세포 간 신호 전달을 위해 단백질과 RNA를 운반하는 이 소포체들은, 특히 암 세포에서 많이 발생이 된다고 알려져있다. 하지만 각 소포체들이 하는 일은 아직 모두 밝혀지지 않았고, 분리하는 방법과 소포체 안의 내용물들의 특징에 대해서는 초기 연구 단계에 있다. 또한 선행된 연구의 대부분은 RNA와 관련된 일이고, 이는 단백질로 번역되었을 때 신호에 관한 정확한 정보는 주지 못한다. 본 연구실에서는 폐암과 관련된 EGF 수용체 단백질, 즉 EGFR의 세포 신호전달을 단분자 면역침강기법을 통해서 측정하였고, 그 결과 같은 유전자를 가진 세포주라도 단백질-단백질 상호작용은 다를 수 있음을 알아내었다. 이 기법을 기반으로 세포 외 소포체에 있는 EGFR에 대해서도 단백질 간의 상호작용을 측정하였다. 모세포에서 나온 세포 외 소포체는 모세포와 같은 단백질을 가지고 같은 기능을 할 것으로 예측되었으나, 생성기전이 다른 세포 외 소포체는 같은 단백질을 가지고 있어도 신호를 전달하는 단백질 간의 상호작용의 세기가 다르다는 것을 밝혀내었다. 이것은 단백질 수준에서 흥미로운 발견이며, 세포 외 소포체들의 특성을 더 이해할 수 있게 되었다. 모세포의 세포막에서 바로 생성되는 마이크로베시클은 모세포의 특성을 잘 따라가고, 모세포에서 분류 기작을 거치면서 두 번의 내부 출아 후 생성되는 엑소좀은 특정 단백질이 아니라 측정된 세 가지 단백질(PLC$\gamma$, GRB2, p85$\alpha$)과의 상호작용이 비슷함이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해, 마이크로베시클은 모세포 신호를 추적할 때 용이하며 엑소좀은 세포 외 소포체를 이용한 궁극적인 암 진단과 치료 가능 여부에 적용될 수 있다는 점에서 본 연구가 가지는 의의를 찾을 수 있다. 신경 전달 물질의 이동에 관련된 신경소포체의 세포 막 융합 기작 또한 아주 중요한 연구로, 가장 기본적인 소포체 수송과 막 융합부터 넓게는 신경과 관련된 암의 치료에 이르기까지 이 연구를 통해 발전할 수 있는 분야들이 많다. SNARE 복합체는 막 융합을 일으키는 근본적인 단백질이고, 시냅토태그민은 칼슘 농도에 따라 융합의 정도를 조절하는 조절 단백질이다. 또한 이 칼슘 조절자는 수 마이크로 몰 칼슘 농도에서도 밀리 초 단위로 칼슘에 반응하므로 기본적으로 이것을 잘 구현하는 실험을 개발하는 것이 목적이자 그를 통해 세부 기작을 탐구하고자 한다. 본 연구는 수 마이크로-수 밀리 몰농도 사이의 칼슘 농도에서 칼슘 의존적인 막 융합 반응을 다각도로 구현하여 분석하였다. 인지질의 구성 요소를 달리하여 시냅토태그민과 막의 상호작용을 살펴보았고, 나아가 막 융합 (lipid mixing) 뿐만 아니라 내용물의 융합 (content mixing)까지 단분자 수준에서 측정하였다. 실시간 이미징 기법을 통해 적은 칼슘 농도에서도 내용물 융합이 일어나는 것을 관찰하였고, 소포체 안의 물질 유실이 아닌 두 소포체의 융합으로 인한 신호임을 시뮬레이션을 통해 신뢰할만한 결과로 보여주었다. 이 소포체 모사 기법을 통해 신경소포체 융합 과정의 중간 단계인 kiss-and-run, pore expansion 등을 정밀하게 연구할 수 있을 것으로 기대한다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DPH 17032
형태사항 vii, 63 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 성미숙
지도교수의 영문표기 : Yong-Hoon Cho
지도교수의 한글표기 : 조용훈
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 물리학과,
서지주기 References : p. 59-62
주제 Extracellular vesicles
EGFR
protein-protein interaction
membrane fusion
synaptotagmin1
SNAREs
세포 외 소포체
EGF 수용체
단백질 상호작용
막 융합
시넵토태그민
스네어
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