Many proteins in living cells undergo numerous post-translational modifications (PTM) including phosphorylation, methylation, acetylation, and so forth. Such modifications play key roles in various cellular processes by regulating protein functions. Hence, an efficient way of installing particular modification site-specifically on protein can give us clues to understand how biological functions are controlled in cells. However, conventional chemical modifications have been limited to installation of PTM mimics. Alternatively, genetic code expansion enabled specific incorporation of modified amino acids, but it requires selective evolution process for each amino acid, and many PTMs are still left unconquered by this technique. Here, we present a novel protein chemical modification strategy integrating the two approaches: Marking-Activation-Coupling (MAC) scheme. In brief, the modification site is marked by site-selective incorporation of precursor amino acid, followed by activation of the marked site and coupling of target PTM moiety on the position via chemoselective conjugation. In this study, we demonstrated our system by selective PTM installation on proteins and biochemical assays using the modified proteins. Using MAC scheme, we produced modified histone H3 variants carrying three different methylation states (Kme1, Kme2, Kme3), respectively. Then, we validated the H3K79 methylation enhances histone acetylation, eventually leading to the increase of transcription level. We expect the MAC scheme may shed new light on disclosing biological meanings of diverse protein modifications occurring in our cells.
Protein phosphorylation, the most prevalent PTM in mammalian proteome, is one of the extensively studied research subjects due to its vital regulatory roles. Genetic incorporation of phosphoserine has been successfully applied to produce site-specifically phosphorylated protein in high yield since it was first developed in 2011. Here are the four recent applications using a much improved phosphoserine incorporation system to reveal the roles of phosphorylation in various cellular processes: histone crosstalk, neurodegenerative diseases, NF-κB pathway, and DNA sensing pathway. The diverse applications successfully revealed the generality and utility of our system.
세포 내 단백질들은 인산화, 메틸화, 아세틸화 등의 많은 번역 후 변형을 겪게 된다. 이러한 변형들은 단백질 기능을 조절하여 다양한 세포 내 프로세스에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 단백질의 특정 위치에 원하는 변형을 설치할 수 있는 효율적인 방법은 생물학적 기능의 조절 기작을 이해하는데 중요한 단서들을 제공할 수 있다. 그러나 기존의 화학적 단백질 변형 방법들은 번역 후 변형의 유사체를 만들어 낼 수 밖에 없다는 한계점이 존재한다. 비천연 합성 단백질의 생합성 기술을 통한 변형 방법도 존재하지만 각 변형 아미노산마다 선택적 진화 과정이 필요하고 이 방법으로도 구현되지 못한 변형들도 아직 많이 남아있다. 우리는 여기서 앞의 두 방법을 융합하여 마킹-액티베이션-커플링 세가지 스텝으로 이루어진 새로운 화학적 단백질 변형 방법을 제시하고자 한다. 간략히 설명하면 전구체로 포스포세린을 원하는 변형 위치에 선택적으로 삽입한 단백질을 합성하는 마킹 단계에 이어 포스포세린을 디하이드로알라닌으로 전환시켜 주는 액티베이션 단계, 마지막으로 원하는 변형기를 화학선택적 첨가반응을 통해 부착시켜 주는 커플링 단계로 이어진다. 본 연구에서는 단백질에 위치특이적으로 번역 후 변형을 시켜준 후 생화학적 분석방법을 통해 고안된 변형 시스템을 검증해 보기로 하였다. 새로운 변형 시스템을 통해 히스톤 H3 단백질의 라이신 79번 자리에 모노, 다이, 트라이 세가지 종류의 메틸화 변형을 시켜준 단백질을 각각 얻은 후 이것을 사용하여 시험관 전사 분석을 진행하자 라이신 79 메틸화가 히스톤 아세틸화 변형을 촉진하고 전사 정도가 증가하게 된다는 것을 밝혀낼 수 있었다. 이와 같이 새로운 단백질 변형 방법을 통한 위치특이적 번역 후 변형 방법이 세포 내에서 일어나는 다양한 단백질 변형의 생물학적 역할을 규명하는데 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대한다.
단백질 인산화는 포유류 프로테옴에서 가장 많이 일어나는 번역 후 변형으로 이것이 생체 내에서 갖는 중요한 역할 때문에 많이 연구되어 온 변형 중 하나이다. 포스포세린 첨가 단백질의 생합성 기술이 2011년에 처음 개발된 이후 다양한 위치특이적 인산화 단백질을 높은 효율로 합성하는데 성공적으로 응용되었다. 본 학위 논문에서는 더 향상된 포스포세린 첨가 단백질 생합성 기술을 이용한 네 가지 최근 응용사례들을 통해 이 기술이 다양한 세포 내 프로세스에서 인산화의 역할을 밝히는데 큰 역할을 할 수 있음을 보여주고자 한다.
