Primary cilia are evolutionarily conserved organelles composed of nine outer doublets of microtubule and protruded outside from cell membrane, and their functions are detection of chemical and mechanical signal from extracellular environment. Primary cilia formation are interconnected with numerous cellular and molecular mechanisms such as actin dynamics, cell cycle and cell migration, suggesting that large numbers of regulators work in ciiliogenesis. To identify novel regulators of ciliogenesis, we performed a small-scale siRNA library screen and identified CCDC41 (CEP83), an uncharacterized protein composed of multiple coiled-coil domains. CCDC41 specifically localizes to the distal end of the mother centriole and interacts with the distal appendage component Cep164. Remarkably, knockdown of CCDC41 inhibits the recruitment of IFT20 to the centrosome. Moreover, depletion of either CCDC41 inhibits ciliogenesis at the ciliary vesicle docking step. These study revealed that CCDC41 plays a role as a linker between the mother centriole and other ciliary proteins during the initial stage of ciliogenesis. Recently, biallelic mutations of CCDC41 were identified in seven families. Early-onset nephronophthisis was observed in all affected individuals and learning disability and/or hydrocephalus were displayed in four out of eight individuals. We revealed that whereas wild-type CCDC41 protein showed centrosomal localization and dominant-negative effects on CEP164 localization, CCDC41 p.Gln692del, p.Glu669Aspfs*14 and p.Glu684del variants accumulated into the nucleus and failed to localize at the centrosome. We revealed that this mis-localization of CCDC41 induces that excessive ac-cumulation of CEP164 in centrosome and the excess inhibits the ciliogenesis.
Defects in structures and functions of primary cilia cause a range of hereditary disorders called ciliop-athies, such as nephronophthisis, Bardet-Biedl syndrome, Joubert syndrome and Meckel-Gruber syndrome. Because primary cilia play key roles in cerebellar development, mechano-, chemo- and photo-sensation, their defective phenotypes emerge as a variety of developmental and degenerative disorders in diverse organs. In order to identify mutated genes in Korean individuals presumed ciliopathies, we performed a trio-based NGS approaches on affected individuals. Four individuals with ciliopathies, but not detected mutation in known genes associated with ciliopathies were enrolled. As a result, we have identified three genes with a rare variant from separate Joubert syndrome patients. One affected individual carried an X-linked recessive mutation of OFD1 at the splice acceptor site (c.1654-5G>C) with high conservation score. Different biallelic mutations (c.518C>G, c.8113C>T) of gene encoded C5orf42 protein were identified in another individual. A nonsynon-ymous substitution (c.3272G>T) in SHROOM2 gene was identified in the other patient. Among mutated genes, the specific function of C5orf42 remains elusive. Accordingly, we have investigated the function of C5orf42 and the pathologic mechanism of C5orf42 impairment. Here, we revealed that C5orf42 (JBTS 17, OFD6) dynamically localizes to the nuclear pore and the kinetochore in a cell cycle dependent manner. Exog-enously expression of the evolutionarily conserved domain of C5orf42 (Joubert syndrome associated con-served domain, JCD) inhibits the mitotic entry by blocking NEBD and mitotic regulation at the kinetochore. Depletion of C5orf42 displays a prolonged mitosis and defects in cell cycle regulation and chromosome seg-regation, and induces the failure of mitotic arrest by inhibiting the increase of the spindle assembly check-point protein BUBR1 and by inducing defects in a coordination of the mitotic checkpoint proteins such as AurkB and, PLK1. Moreover, NEK6, a regulator of mitotic progression directly interacts with JCD. These re-sults suggest that C5orf42, a ciliopathy protein associated with Joubert syndrome and OFD VI, regulates the mitotic progression by coordinating the spindle assembly checkpoint activation and the assem-bly/disassembly of the nuclear envelope. This incongruity may cause the cilia associated developmental dis-orders, including Joubert syndrome and its related disorders.
원발 섬모는 진화적으로 잘 보존된 세포소기관으로서, 아홉 쌍의 이중 미세소관과 이를 둘러싼 막으로 이루어져있다. 원발 섬모는 세포 외부 환경으로부터 오는 여러 물리, 화학적 자극을 인지하는 기능을 담당하고 있다. 원발 섬모의 형성에는 세포 내 액틴 구조의 변화와 세포 분열 및 세포 이동을 비롯한 다양한 세포적, 분자적 기전이 관여하게 되는데, 이는 원발 섬모의 형성에 많은 조절인자들이 관여하고 있음을 시사한다. 본 연구자는 섬모 형성의 새로운 조절 인자를 발굴하기 위해서 RNA 간섭 현상을 이용한 스크리닝을 진행하였고, 여기서 CCDC41(CEP83)라는 새로운 조절인자를 발굴하였다. CCDC41은 수 많은 이중 나선 구조로 이루어진 단백질로 중심립의 말단 부위에 위치하여, 모체 중심립의 원위부 부속기의 주요 성분인 CEP164와 상호작용을 한다. CCDC41을 억제하면 ITF20의 중심체로의 이동이 억제되고, 원발 섬모 소체의 부착을 억제하여 섬모 형성 시작 되지 않게 된다. 본 연구를 통해서 원발 섬모 형성의 초기 단계에서CCDC41이 모체 중심립과 다른 섬모 단백질 사이의 연결 고리와 같은 역할을 담당하고 있음을 밝혔다. 이어서, 공동 연구팀에서 CCDC41의 새로운 인간 돌연변이를 일곱 가족에서 발견하였고, 본 연구자는 이에 대한 기능 연구를 진행하였다. 정상 CCDC41 단백질을 과발현 시키면 주로 모체 중심립에 위치하여 CEP164의 억제를 유발하지만, p.Gln692del, p.Glu669Aspfs*14, p.Glu684del 을 가진 돌연변이 CCDC41을 과발현 시킬 경우 핵 내에 축적되고 중심체에서의 발현이 감소하게 되는데, 이러한 CCDC41발현 위치 이상이 과도한 CEP614의 발현을 유도하여 원발 섬모 형성을 억제하는 것을 확인하였다.
다음으로 앞선 연구 방향과는 다르게, 원발 섬모 병증 환자에게서 유전자 돌연변이를 발견하고 이를 규명하는 방식의 연구를 진행하였다. 원발 섬모 병증은 콩팥황폐증, 바뎃 비들 증후군, 주버트 증후군 및 멕켈 그루버 증후군과 같이 원발 섬모의 구조 및 기능적 이상으로 유발되는 유전 질환들을 일컫는 말이다. 원발 섬모는 소뇌 발달과 세포 외의 물리, 화학적 신호를 감지하는 역할을 하기 때문에 이러한 원발 섬모의 이상은 다양한 기관에서 발달 및 퇴행적인 이상을 동반하게 된다. 본 연구자는 한국인 섬모 병증 환자에서 whole exome sequencing 과 trio-analysis 기법을 이용하여 유전자 변이를 밝히고자 하였다. 결과적으로 네 명의 환자 중에서 세 명의 주버트 증후군 환자에서 각각 ODF1 유전자의 splice acceptor site에서의 돌연변이와, C5orf42 유전자의 복합 이형접합성 돌연변이 (compound heterozygosity), SHROOM2 유전자 돌연변이를 발견할 수 있었다. 이러한 유전자들 중에서 C5orf42가 섬모 발달 과정에서 미치는 영향과 이 유전자의 돌연변이 발생 시에 나타나는 병적 메커니즘에 대한 연구가 충분히 되어있지 않아서 이에 대한 연구를 진행하였다. C5orf42 단백질의 C 말단기 근체에 진핵 생물에서 공통적으로 나타나는, 진화적으로 보존된 영역이 존재하는데, 이를 과발현시킬 경우 세포 분열 M기 진입이 억제되는데, 이는 핵막의 파쇄가 억제되고 염색체의 방추사 부착부위에 작용하는 단백질을 억제되는 기전에 의해서 나타나게 된다. C5orf42를 억제하면 세포 분열 M기에 있는 세포들이 증가하고 염색체 분리의 이상이 관찰된다. 또한, noco-dazole에 의해서 유발되는 세포분열 전중기에 멈춤 현상이 일어나지 못하는데, 이는 C5orf42가 spindle assembly checkpoint의 주요한 인자인 BUBR1를 방추사 부착부로 모으는데 중요한 역할을 담당히기 때문으로 생각된다. 또한, C5orf42의 억제시에 세포 내의 Aurora kinase B와 PLK1의 이상 증가가 관찰되며, C5orf42는 NEK6와 상호작용을 하여 이러한 세포 분열을 조정하는 것을 관찰할 수 있었다. 결론적으로 C5orf42는 세포 분열 과정의 조절 인자 중에 하나이며 spindle assembly check-point의 활성화와 핵막의 형성과 파쇄의 시기를 조절함으로써 세포 분열을 조절하는 것으로 생각된다. 이러한 C5orf42의 이상 시 세포 분열의 이상이 야기될 수 있으며, 이러한 이상이 주버트 증후군의 병적 메커니즘과 관계되었을 것으로 생각된다.
