The ubiquitin-proteasome system (UPS) regulates various cellular pathways, such as signaling, proliferation and apoptosis by modulating degradation of target proteins through multi-step catalyzed reaction, which consist of three disparate enzymes. E1; ubiquitin activating enzyme, E2; ubiquitin conjugating enzyme, and E3; ubiquitin ligase complex. Among E3 ligase complexes, Cullin-Ring finger E3 ubiquitin ligase (CRL) family has been extensively studied. CRL is composed of Cullin scaffold protein, RING box protein, an adaptor protein and a substrate receptor protein, and the substrate receptor confers substrate specificity to CRL by recruiting target proteins to the E3 ubiquitin ligase complex.
Here, I identified ankyrin repeat domain 9 (ANKRD9), as a novel substrate receptor for CRL. Using quantitative proteomic methodologies in conjunction with immunoblotting and in-vitro binding assays, I showed that ANKRD9 forms a complex with components of Cul5 E3 ubiquitin ligase complex, including EloB, EloC and Cul5. Interestingly, ANKRD9 contains unique SOCS box from that of other substrate receptor proteins in that the BC box within SOCS box of ANKRD9 is not conserved. Furthermore, I identified Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH) as a substrate for ANKRD9. IMPHD is the rate-limiting enzyme in de novo biosynthesis of guanine nucleotide, implicated for cellular proliferation and cancer. In addition, overexpressing ANKRD9 reduces and downregulating ANKRD9 increases IMPDH protein level.
Taken together, our results suggest that ANRKD9 functions as a novel substrate receptor for CRL and regulates IMPDH level through proteasomal degradation.
유비퀴틴(ubiquitin)은 8.5 kD의 작은 단백질로 다양한 표적 단백질에 결합 (ubiquitination or ubiquitylation) 함으로써 표적 단백질의 분해, 활성 및 위치 변화, 세포 내 신호전달 등의 다양한 대사 과정을 조절한다. 많은 경우 유비퀴틴이 결합된 단백질은 프로테아좀으로 이동하여 분해되는 과정을 거치며 이 과정은 유비퀴틴 프로테아좀 시스템 (The ubiquitin-proteasome system, UPS)에 의해 조절된다. 유비퀴틴 전달 과정은 유비퀴틴 활성화 효소 (E1; ubiquitin activating enzyme), 유비퀴틴 접합 효소 (E2; ubiquitin conjugating enzyme), 유비퀴틴 전달 효소 (E3; ubiquitin ligase enzyme)들의 순차적인 작용에 의해 이루어진다. 표적 단백질을 인식하는 역할을 하는 E3효소는 the E6-associated protein Carboxyl Terminus (HECT) family, the really interesting new gene (RING) family, the U-box family, the RING-between-RING (RBR) family 가 알려져 있다. 특히 E3 효소 중 가장 잘 연구된 Cullin-RING finger E3 ubiquitin ligases (CRL) family는 스캐폴드 단백질 역할을 하는 Cullin 단백질, E2 효소 결합 단백질인 RING 박스 단백질 (RING box protein), 어댑터 단백질 (adaptor protein) 및 표적 수용체 단백질 (substrate receptor)로 구성이 되어 있다. Cullin 단백질은 Cul1, 2, 3, 4A, 4B, 5, 7과 9으로 이루어져 있으며 이들에 따라 각각의 복합체를 형성한다. CRL family의 다양한 구성 단백질 중 특히 표적 수용체 단백질의 경우 표적 단백질을 직접 인식하기 때문에 단백질 분해 과정에 매우 중요한 역할을 하며, 세포 증식, 성장, 분열 및 죽음 등의 다양한 세포 내 대사 과정에 직접적인 작용을 한다.
본 연구에서는 새로운 Cullin-RING finger E3 ubiquitin ligases (CRL) family의 표적 수용체로서 ankyrin repeat domain 9 (ANKRD9) 의 기능을 처음으로 규명하였다. ANKRD9는 ankyrin repeat domain을 포함하는 35 kDa의 단백질로서 유전자 및 단백질은 척추동물에서 진화적으로 잘 보존되어 있으나 세포 내의 기능을 잘 알려져 있지 않았다. 따라서 ANKRD9의 기능을 밝히고자 질량분석학 기반의 실험 (LC-MS/MS) 및 면역학적 블로팅 (Immunoblotting) 을 바탕으로 ANKRD9가 Cul5 E3 ubiquitin ligase 복합체의 구성 요소인 Rbx2, Eloingin B (EloB), Elongin C (EloC) 및 Cul5 단백질들과 상호 작용한다는 것을 규명하였으며 ANKRD9이 EloB, EloC, Cul5 N 말단 단백질들과 안정적으로 복합체를 형성하는 것을 확인하였다. 또한 ANKRD9은 다른 Cul5 E3 ubiquitin ligase 복합체의 표적 수용체들 사이에서 보존이 되어 있는 SOCS 박스의 일부를 포함하는 것으로 밝혀졌다. SOCS 박스는 어댑터 단백질인 EloB 및 EloC와 상호작용하는 BC 박스와 Cul5 단백질과 상호작용하는 Cul5 박스로 구성이 되어 있다. ANKRD9의 경우 BC박스는 상대적으로 보존이 잘 되지 않은 반면 Cul5 박스 부분이 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다. 따라서 ANKRD9의 SOCS 박스만 포함하는 단백질 (a.a. 272-317) 이 EloB, EloC, Cul5 N말단 단백질들이 안정적으로 복합체를 형성하는데 충분한 지 확인하는 실험을 진행하였고 이를 바탕으로 이들로 구성된 단백질 크리스탈을 제작하고자 하였다. 그 결과 ANKRD9은 잘 알려진 다른 Cul5 E3 ubiquitin ligase의 표적수용체들과 같이 SOCS 박스를 통해 다른 구성요소들과의 상호작용을 하여 안정적으로 복합체를 이루며 단백질 크리스탈을 형성하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 다양한 Cul5 E3 ubiquitin ligase 복합체의 표적 수용체들이 ANKRD9처럼 ankyrin repeat domain과 SOCS 박스를 포함한다고 알려져 있다. 따라서 이러한 사실 등을 바탕으로 ANKRD9이 다른 Cul5 E3 ubiquitin ligase의 구성요소, 특히 표적 수용체로서 작용하는 것을 확인하였다.
뿐만 아니라 monophosphate dehydrogenase (IMPDH)이 ANKRD9의 표적 단백질임을 규명하였다. IMPDH 단백질은 구아닌 뉴클레오티드 합성에 관여하는 효소로써 세포 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 동형 단백질인 IMPDH1, IMPDH2으로 구성되어 있다. 또한 다양한 암세포에서 과발현 되어 있기 때문에 이를 이용한 항암제들도 개발되고 있다. 그러나 IMPDH의 기능에 대한 많은 선행 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고 아직까지 IMPDH의 조절 기작에 대해서는 밝혀진 것이 거의 없다. 본 연구에서는 ANKRD9이 증가한 세포와 ANKRD9이 감소한 세포에서 IMPDH 단백질이 각각 감소하거나 증가하는 것을 통해 ANKRD9이 IMPDH 단백질 양을 억제하는 것을 밝혔다. 뿐만 아니라 ANKRD9과발현 세포주에서 Cul5의 양을 감소하였을 때 IMPDH 단백질 양이 증가하였다. 즉 ANKRD9이 과발현 하였을 때 Cul5에 의해 IMPDH2의 분해가 조절되는 것을 확인하였다.
본 연구는 다양한 ANKRD9의 상호작용 단백질들을 단백체학 수준에서 처음으로 규명하였고 이를 통해 Cul5 ligase complex의 기질 수용체로써 ANKRD9의 기능을 밝혔다. 또한 ANKRD9및 Cul5에 의해 IMPDH 단백질 수준이 감소하는 것을 규명함으로써 IMPDH 단백질 분해에 의한 새로운 세포 증식 조절 기작 규명의 발판을 만들었다. 뿐만 아니라 ANKRD9 SOCS 박스, EloB, EloC 및 Cul5 N 말단을 포함하는 단백질 크리스탈을 제작함으로써 새로운 기질 수용체인 ANKRD9을 포함하는 Cul5 E3 ubiquitin ligase 구조 규명의 가능성을 열었다.
