Glaucoma, the major cause of visual blindness throughout the world, is characterized by optic nerve degeneration and visual defects. Primary open angle glaucoma (POAG; MIM 137760) is the most common type of glaucoma that generally accompanies elevated intraocular pressure (IOP). One subtype of POAG where the patient who has an IOP within the normal range of < 22 mmHg, is classified as normal tension glaucoma (NTG). Although the exact mechanism of glaucoma has not been completely established, it is most likely a genetically heterogeneous disorder resulting from the interaction of multiple genes and environmental factors. Identifying the unknown genetic factors to contribute the POAG development is necessary to understand the pathogenesis of glaucoma and consequently discover the therapeutic target.
In this study, novel POAG associated variants and gene were discovered using single nucleotide polymorphisms (SNP) based case-control association study which is very effective tools to identify the common modest-risk variants of complex diseases. To elucidate the genetic association in POAG etiology, the functional study was performed using animal model of glaucoma. In addition, replication study was also conducted using Korean population to validate previously discovered POAG associated gene through genome wide association study (GWAS) in other population.
Transferrin (TF) was regarded as promising candidate gene for POAG because the genomic position was mapped on the human chromosome 3q22.1, which was previously identified as a putative POAG locus. Transferrin expression was increased in POAG patients and it has protected various cells from several pathologic conditions implicated in glaucoma pathogenesis. In addition, it was reported that the cellular uptake of transferrin was blocked by mutation of OPTN known to one of glaucoma causing genes. To determine the genetic association of transferrin with POAG, eighteen tag SNPs were selected in 3kb either side of TF gene, and genotyped in 348 POAG patients and 932 controls of Korean ancestry. Two intronic SNPs, rs8177215 (OR=1.6, p=0.00061) and rs1880669 (OR=0.71, p=0.00072), were significantly and independently associated with POAG susceptibility. Especially, individuals carrying two risk alleles (AA) of rs8177215 had 2.9 fold increased odds of having POAG (OR=2.9, p=0.00023 in recessive model). There was no preferential association with POAG according to IOP level or gender.
The imputation was performed to infer the alleles of ungenotyped SNP probably significantly associated with POAG. Total six imputed SNPs were significant association with POAG susceptibility (0.0025 ≤ p ≤ 0.000045). The functional prediction for all POAG associated SNPs in TF revealed that one imputed SNP (rs1799852) located in 48bp from 5’end of TF exon 7 had a function as an exon splicing enhancer (ESE). The POAG risk allele (T) of rs1799852 was expected to disrupt binding of splicing factor. As a matter of fact that two minor allele (TT) increase 2.9 fold risk of POAG, decreased expression of transferrin resulted from aberrant splicing may increase the susceptibility of POAG. In addition, the risk allele of most POAG associated SNPs were known to decrease the serum transferrin level in human clinical studies.
To validate the POAG association with TF and influence of transferrin amount in glaucomatous injury, the role of transferrin was examined in acute high IOP induced retina ischemia reperfusion model in SD rats. Transferrin level was significantly increased at 12 hs and 24 hs after retinal ischemia reperfusion injury by 4.1±0.5 and 4.5±0.6 fold respectively compared with control retina (p<0.01). The expression of ceruloplasmin, which is required for iron binding activity of transferrin, was also increased after 12 hs and 24 hs by 2.6±0.6 and 3.0±0.8 fold respectively (p<0.05). Intraperitoneally injected apotransferrin was well delivered to retina and significantly decreased apoptotic cell in GCL region (13.8±6.4 ) compared with vehicle treated retina (36.1±11.7) at 6 hs after ischemia (p<0.001). In addition, daily administration of apotransferrin enhanced RGC survival by an approximately 20% compared with vehicle treated ischemic retina at 6 days after ischemia.
In conclusion, transferrin level determinant TF SNPs were associated with POAG susceptibility. Systemic apotransferrin administration, which mimicked the high concentration of transferrin level by genotype of human, significantly enhanced RGC survival. This study implicates that transferrin amount is important in pathologic condition of glaucoma development.
The human CAV1-CAV2 locus had been associated with susceptibility to primary open-angle glaucoma in four studies using Caucasian, Chinese, and Pakistani populations, although not in several other studies using non-Korean populations. In this study with Korean participants, the CAV1-CAV2 locus was investigated for associations with susceptibility to primary open-angle glaucoma accompanied by elevated intraocular pressure (IOP), namely high-tension glaucoma (HTG), as well as with IOP elevation, which is a strong risk factor for glaucoma.
Two single-nucleotide polymorphisms (SNPs) were genotyped in 1,161 Korean participants including 229 HTG patients and 932 healthy controls and statistically examined for association with HTG susceptibility and IOP. One SNP was rs4236601 G>A, which had been reported in the original study and the other SNP was rs17588172 T>G, which was perfectly correlated ($r^2$=1) with another reported SNP rs1052990. The expression quantitative trait loci (eQTL) analysis was performed using the Genevar data.
Both SNPs were associated with HTG susceptibility, but rs4236601 association disappeared when adjusted for rs17588172 genotype and not vice versa. The minor allele G of rs17588172 was associated significantly with 1.5-fold increased susceptibility to HTG (p=0.0069) and marginally with IOP elevation (p=0.043) versus the major allele T. This minor allele was additionally associated with decreased CAV1 and CAV2 mRNA in skin and adipose according to the Genevar eQTL analysis.
In conclusion, the minor allele G of rs17588172 in CAV1-CAV2 locus is associated with decreased expression of CAV1 and CAV2 in some tissues, marginally with IOP elevation and consequently with increased susceptibility to HTG.
세계적으로 실명의 주요 원인인 녹내장은 시신경의 퇴화와 시력 손상을 일으킨다. 원발성 개방각 녹내장 (POAG; MIM 137760)은 녹내장의 가장 흔한 유형으로 일반적으로 고안압을 동반한다. 하지만 원발성 개방각 녹내장 환자중 정상 안압으로 분류되는 22 mmHg 이하의 안압을 가지고 있으면 정상 안압 녹내장으로 분류한다. 현재까지 녹내장을 유발하는 정확한 기작은 알려지지 않았지만 여러 유전자들과 환경적인 요소들의 복합적인 상호작용을 통한 것으로 보고 있다. 따라서 원발성 개방각 녹내장의 발생에 기여하는 아직 알려지지 않은 유전적인 요소들을 밝히는 것은 발병 기작과 치료 타겟 발굴을 위해 필수적이다.
이번 연구에서는 다인성 질환에서 연관 유전변이 발굴에 매우 유용한 단일 염기 다형성 (Single nucleotide polymorphism; SNP)을 이용한 환자군-대조군 연관 연구법을 통해 원발성 개방각 녹내장과 연관된 유전변이와 유전자를 발견하였다. 녹내장 발병에서 발견된 유전변이 및 유전자의 역할을 확인하기 동물 녹내장 모델을 이용하여 기능 연구가 이어 진행되었다. 또한 한국인 녹내장 환자와 대조군을 샘플을 가지고 다른 인종에서 유전체 전체 연관 연구법 (Genome wide association study) 통해 발견된 녹내장 연관 변이의 재현성 연구가 진행되었다.
트랜스페린 (TF) 은 원발성 개방각 녹내장의 잠재적인 후보 유전 구역인 3q22.1에 위치하며, 녹내장 환자에서 발현 양이 증가하는 것으로 보고 되었다. 또한 녹내장 발병과 관련된 여러 조건에서 트랜스페린이 다양한 세포 보호 효과를 나타내었으며 녹내장 발병을 직접적으로 유도하는 OPTN 돌연변이를 통해 트랜스페린의 세포 유입 방해가 알려져 있으므로 녹내장 후보 유전자로 간주되었다. 트랜스페린 유전자와 녹내장의 연관성을 규명하기 위해 트랜스페린 유전자 3kb 주변 구역에서 18개의 tag SNP가 선택 되었으며, 341 명의 녹내장 환자와 932명의 대조군에서 유전형 분석이 실시하였다. 그 결과 두 개의 인트론 지역에 있는 SNP인 rs8177215 (OR=1.6, p=0.00061) 와 rs1880669 (OR=0.71, p=0.00072) 이 독립적으로 녹내장과 연관성을 나타내었다. 특히 rs8177215의 녹내장 위험 대립형질 두 개를 가진 사람의 경우 그렇지 않은 사람보다 2.9배나 녹내장에 걸릴 확률이 높았다 (열성 모델, OR=2.9, p=0.00023).
트랜스페린 유전자 주변에서 유전형분석이 되지 않은 SNP를 분석하기 위해 imputation 을 통한 자세한 분석이 진행되었다. 그 결과, 6개의 imputed SNP가 녹내장 발병 감수성과 연관되어 있었다 (0.0025 ≤ p ≤ 0.000045). 총 8개의 녹내장 연관 SNP 기능을 프로그램을 통해 예측해본 결과 트랜스페린의 엑손 구역에 위치한 rs1799852가 exon splicing enhancer (ESE) 부분에 있다는 것을 알 수 있었으며, 녹내장 위험 대립형질이 splicing factor가 ESE에 결합 하는 것을 막는 것으로 예측이 되었다. rs1799852의 녹내장 위험 대립형질 두 개를 가질 경우 2.9배의 녹내장 발병 위험성이 있는 것으로 볼 때, 잘못된 splicing을 통한 트랜스페린 발현 감소가 녹내장 발병 위험을 증가 시킬 것으로 보인다. 또한 트랜스페린 유전자 지역에서 녹내장과 연관된 SNP의 녹내장 위험 대립 형질이 혈액 내 트랜스페린 양을 줄인다는 보고 역시 이를 뒷받침한다.
트랜스페린의 녹내장 연관성과 트랜스페린 양의 녹내장 발병에 대한 영향을 확인하기 위해 SD rat에서 급성 고안압 유도를 통한 망막 허혈성 재관류 모델에서 트랜스페린의 역할을 검증해 보았다. 녹내장 환자에 보인 것과 마찬가지로 망막 허혈성 재관류 손상후 12시간과 24시간이 지났을때 트랜스페린 양이 정상 망막에 비해 4.1±0.5 배, 4.5±0.6 배 증가하였다. 트랜스페린의 철분 결합을 위해 필요한 ceruloplasmin또한 2.6±0.6 배, 3.0±0.8 배 증가하였다. 복강을 통해 주입된 트랜스페린 (apotransferrin)은 망막으로 효율적으로 전달되었으며. PBS를 주입한 망막이 허혈 후 6시간이 지난 뒤 시신경 층에 36.1±11.7 개의 세포 사멸이 일어난 것에 비해 트랜스페린 (apotransferrin)을 주입한 망막에는 13.8±6.4개로 상당히 줄어들었다. 또한 망막 허혈 후 6일 뒤까지 트랜스페린 (apotransferrin)을 매일 주입한 결과 PBS를 주입한 것에 비해 시신경 세포 생존이 약 20%가량 증가하였다.
트랜스페린 단백질의 양을 조절에 결정적인 SNP들은 원발성 개방각 녹내장과 상당한 연관이 있었다. 또한 인간에서 유전형에 따른 높은 트랜스페린 양을 대체하는 복강을 통한 트랜스페린 단백질 주입은 동물 녹내장 모델에서 시신경세포 생존을 증가시켰다. 따라서 이 연구는 트랜스페린 단백질 양이 녹내장 발병에 있어서 중요한 역할을 한다는 것으로 결론지을 수 있다.
CAV1-CAV2 유전구역은 백인, 중국, 파키스탄 인종에서 원발성 개방각 녹내장과 연관성이 있다고 알려 왔지만 다른 연구에서는 연관성이 나타나지 않았다. 이번 연구에서는 한국인에서 CAV1-CAV2 유전구역이 고안압을 동반한 원발성 개방각 녹내장 (HTG) 발병 및 고안압과 연관성이 있는지 재현성 연구가 진행되었다.
이전 첫 CAV1-CAV2 연구에서 보고 되었던 rs4236601과 또 다른 후보 SNP인 rs10052990과 한국인에서 완벽한 linkage disequilibrium (LD)를 가지는 rs1758812의 유전형이 229명의 HTG 환자와 932명의 대조군을 포함한 1,161명의 한국인에서 분석되었고, HTG 및 안압 과의 연관성이 조사되었다. 또한 Genevar 데이터를 통해 각각의 SNP가 CAV1 또는 CAV2 유전자 발현에 영향이 있는지 분석 되었다.
그 결과, 두 SNP 모두 HTG와 연관성이 있었지만 rs4236601의 연관성은 rs17588127의 유전 형질을 통한 조정 후 연관성이 없다는 것으로 나타났다. rs17588172의 소수 대립형질 (minor allele)은 다수 대립형질 (major allele)에 비해 HTG 발병을 1.5배 증가시키는 것으로 나타났고 (p=0.0069), 안압 상승과 약간이나마 연관성이 있는 것으로 나타났다 (p=0.043). 이 소수 대립형질은 추가적으로 피부 및 지방 조직에서 CAV1과 CAV2 유전자 발현 감소와 연관성이 있었다.
따라서, CAV1-CAV2 유전구역에 위치하는 rs17588172의 소수 대립형질인 G는 CAV1과 CAV2유전자 발현을 감소를 통해 작은 영향이지만 안압 상승을 유도하고 결론적으로 고안압을 동반하는 개방각 녹내장 감수성을 증가시키는 것과 연관 있는 것으로 보인다.
