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Intracellular nanoparticle-based display system for high-throughput selection of protein binders = 세포 내 불용성 단백질 구조체를 이용한 결합단백질의 초고속 선별 기술
서명 / 저자 Intracellular nanoparticle-based display system for high-throughput selection of protein binders = 세포 내 불용성 단백질 구조체를 이용한 결합단백질의 초고속 선별 기술 / Yu Jung Kim.
저자명 Kim, Yu Jung ; 김유정
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2016].
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초록정보

Through the past few decades, molecular display technologies have become indispensable for creating binding proteins (binders) with desired properties. Phage display-based affinity panning and flow cytometry combined with magnetic pull-down system have been the primary methods for selecting molecular binders from combinatorial libraries. However, the marginal intensities of signal-to-noise have led to the demand for repetitive rounds of enrichment to isolate positive candidates from libraries. This process is time-consuming, error-prone, and quite laborious. Thus, there is a strong need for high signal-to-noise screening to isolate positive hits rapidly from large libraries. Inclusion bodies (IBs) are generally the result of inactive aggregation of misfolded, nonfunctional proteins, whereas some amyloid-like peptides or viral coat proteins can generate fibrous protein aggregates retaining the explicit functions of the fusion proteins. The fusion of various peptides or enzymes with a cellulose-binding domain (CBD) resulted in the formation of nanoparticles, 20?30 nm in size, with active functions. Based on this, we created a high-density protein binder library of inclusion bodies and attempted to use them as a nanoparticle-type display matrix. First, the designed variable lymphocyte receptor library (VLR), termed “Repebody,” was adopted as the binding moiety on IBs. More than 106 copies of repebody binders could be displayed on CBD particles. To interact with exogenous target molecules, the binders on IBs must be exposed to bulk solutions. For this, we attempted to crack the surface of E. coli cells, while endogenous binders and encoding DNAs are stably maintained inside cells. This technique, named “Intracellular particle display (IPD),” produced extraordinarily high signals, and resulted in the easy isolation of high-affinity binders from an immense number of negative affinity binders. Therefore, we applied the IPD system to create new affinity binders specific for different targets. The resulting binders, specific for each target, were isolated within three rounds of screening, and each round was completed in 1 day. Finally, we applied the IPD system for affinity maturation by competitive screening, resulting in the isolation of subnanomolar affinity binders (H2C13). Structural analysis of the H2C13 and sfGFP complex revealed that the binding affinity was primarily created by interactions between the C-terminal eight amino acids of sfGFP and the first half of the concave surface of the H2C13 repebody. These results proved that this method could be used to improve the binding affinity between interacting proteins, and for the isolation of new affinity binders. Herein, a novel affinity-based library screening system was developed, using nanoparticle-type IBs, to expand the utility of the IPD-based technique to other applications; two additional studies were also conducted. One was an application to isolate new metagenome-originating chaperones, which were detected by the IPD method, as it improves the interaction between target proteins on nanoparticles. As an accessary tool, the ‘Enforced Transcription’ technique, which involves the random insertion of a bidirectional T7 promoter into a metagenomic fosmid library to increase expression of metagenome-originating chaperones, was developed. The second was a novel expression system (ChroV), which expresses target genes on an F´ plasmid, to stabilize the IPD system in E. coli. In this thesis, a novel high-throughput screening system for affinity binders, and two accessary techniques, were successfully developed. When the processes were successfully combined with the IPD system, the binding moiety of the nanoparticle-type IBs could be expanded to genetically-diversified peptides, other binder proteins, or antibodies to recruit fluorescent-labeled target proteins, enzymes, or chemicals. This results in the ability to develop new beneficial functions for biotechnological applications.

생명체가 수행하는 모든 행동은 다양한 물질들과 세포 내 단백질 또는 화학물질들간의 상호작용에 의해 이루어지며, 이를 통하여 세포의 기능을 조절하며 생명을 유지하고 있다. 이러한 단백질 또는 화학물질들에 대한 단백질 바인더의 개발은 질병의 치료 및 진단에 널리 이용되고 있으며 따라서, 거대 단백질 라이브러리에서 원하는 물질에 대한 단백질 바인더를 개발하기 위해서는 디스플레이 시스템의 이용이 필수적이다. 파아지 디스플레이 기반의 바이오팬닝법과 정량적 효모표면 디스플레이 기반의 유세포 형광분석기술이 현재 가장 널리 사용되고 있는 디스플레이 및 고속 스크리닝기술이며, 이 외에도 다양한 기술들이 개발되고 있다. 그러나 현재까지 개발된 방법들 대부분은 라이브러리로부터 원하는 타깃물질에 대한 바인더 발굴을 위해 반복된 스크리닝 과정을 필요로 하며, 이 과정은 높은 위양성 및 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다. 본 연구에서는 단백질 봉입체를 기반으로 하여 단백질 바인더 스크리닝에 소요되는 시간을 획기적으로 단축함과 동시에 위양성을 최소화하여 쉽게 원하는 타깃물질에 대한 단백질 바인더를 탐색 할 수 있는 새로운 시스템을 개발하였다. 일반적으로 단백질 봉입체는 변성단백질의 단순 침전물로 인식되고 있으나 일부 아밀로이드 펩타이드 또는 바이러스성 단백질들은 섬유성 단백질 응집체를 형성하며 이 단백질들과 융합되어 발현된 단백질들이 단백질 봉입체 형태로 생성되면서도 단백질 고유의 생화학적 특성을 상당부분 유지하는 활성형 단백질 입자임이 보고되어 있다. 본 연구에서는 활성형 단백질 입자인 셀룰로모나스 피미 유래의 CBD단백질을 디스플레이 담체로 사용하여 펩타이드 또는 효소를 디스플레이 한 결과, 세포 내에서 20-30 nm 크기의 나노입자 형태의 디스플레이 담체를 형성하며, 디스플레이한 단백질들이 고유의 생화학적 특성을 상당부분 (~30%) 유지하는 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 CBD단백질에 모델 단백질 바인더인 리피바디를 디스플레이 한 결과 한 봉입체 당 $10^6$ 이상의 단백질 바인더가 세포 내에 활성형으로 발현되어 안정적으로 디스플레이 됨을 확인하였다. 다른 세포 표면에 바인더를 디스플레이 하는 시스템과는 달리 본 시스템은 세포 내 단백질 봉입체에 단백질 바인더가 디스플레이 되어 있으므로, 외부 거대 타깃 물질들을 세포 내부로 인가하여 바인더와 상호작용을 유발시키기 위한 방법이 필요 했으며 이에 본 연구에서는 세포 표면에 균열을 형성시키는 방법으로 단백질간 상호작용을 유도 했으며, 이를“세포 내 입자 디스플레이” 라고 명명하였다. 본 연구에서 개발한 세포 균열 방법을 이용하면 외부 타깃 물질은 세포 내부로 쉽게 접근 가능하면서도, 세포 내 바인더가 디스플레이 되어 있는 단백질 봉입체와 유전 정보는 안정적으로 유지되는 특징을 가진다. 즉, 형광 라벨링된 외부 타깃이 균열 세포 내로 인가되어 바인더와 상호작용 하게 되고 해당 세포를 유세포 형광분석기를 이용하여 선택적으로 선별, 회수하는 새로운 방식의 스크리닝 시스템이다. 이 시스템을 이용하면 낮은 위양성 비율로 거대 라이브러리에서 원하는 타깃에 대한 바인더 단백질을 고감도로 선별할 수 있음을 확인하였다. 본 디스플레이 시스템을 실제 라이브러리에 적용하여 여러 종류의 타깃들 (슈퍼폴드 녹색 형광 단백질, 인터루킨-6, 플루오레세인, 덱스트란)에 대해 바인더 단백질 스크리닝을 수행한 결과, 3라운드 이내의 스크리닝만으로도 각 타깃에 대한 바인더를 성공적으로 발굴할 수 있었으며, 타깃의 동일 에피토프에 결합하는 바인더 첨가를 통한 경쟁적 스크리닝을 통해 결합력이 더 강한 바인더를 찾는 친화도 성숙도 쉽게 가능함을 확인하였다. 이러한 스크리닝의 모든 과정은 3일 내에 수행되어 다른 디스플레이 방법들에 비해 현저히 효율적인 방법임을 증명해 보였다. 본 연구의 세포 내 입자 디스플레이 시스템의 확장을 위한 관련된 기술 개발 연구도 부가적으로 수행하였다. 그 중 하나로서, 원하는 타깃의 바인더가 불용성인 경우, 샤페론의 도움으로 불용성 바인더를 활성형으로 전환하여 타깃과 결합할 수 있는 바인더를 찾는 연구에 세포 내 입자 디스플레이 시스템을 적용하고자 하였다. 이에 메타게놈에서 다양한 샤페론들을 찾고자 하였으며, 메타게놈의 유전자 발현을 획기적으로 향상시킬 수 있는“강제전사”기술을 개발하였다. 또 다른 연구로서, 세포 내 입자 디스플레이의 핵심 부품인 CBD단백질 융합 플라스미드를 대장균 내에서 안정적으로 발현하기 위해 F′플라스미드 기반의 발현 시스템인 ChroV 시스템을 구축하였다. 현재 세포 내 입자 디스플레이 시스템은 본 연구에서 진행된 단백질, 케미컬 타깃 외 펩타이드 타깃 등에 대한 바인더를 탐색하는 연구 외에도 레피바디 이외의 단백질 바인더 (안티바디, 비항체 단백질, 펩타이드 등)를 이용한 실험을 수행하고 있으며, 향후 이렇게 발굴된 바인더를 바이오센서 개발 등에 적용 할 계획이다. 본인은 해당 연구를 통해 세포 내 단백질 봉입체를 이용 고효율 디스플레이 및 바인더단백질 고속 탐색 기술을 개발하였다. 이러한 세포 내 입자 디스플레이 시스템이 강제전사 시스템과 ChroV 시스템과 같은 기술들과 효과적으로 결합되면, 단백질바인더 부분이 다양한 펩타이드, 다른 바인더 단백질 또는 항체 등으로 확장되어 형광 표지된 표적 단백질, 효소, 케미컬, 보제 등에 대해 새로운 기능을 가진 바인더들 개발에 효과적으로 이용될 수 있으며, 향후 생명공학 산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대하고 있다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 16028
형태사항 vi, 94 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김유정
지도교수의 영문표기 : Hak-Sung Kim
지도교수의 한글표기 : 김학성
수록잡지명 : "Improved Metagenome Screening Efficiency by Random Insertion of T7 Promoters". Journal of Biotechnology,
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 83-91
주제 Inclusion bodies
high-throughput screening
molecular binder
enforced-transcription
F' plasmid-based expression system
단백질 봉입체
고속대량 스크리닝 기술
단백질 바인더
강제전사
F' 플라스미드 기반 발현 시스템
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