This thesis presents the development of quantitative biomarker analysis technology which can be applied to both of cells and patient tissues in a manner of highly efficient multiplexing. In particular, this development was concentrated on immunochemistry because of its importance in cancer diagnosis. For the achievement of maximized biomarker multiplexity, a microfluidic device which has bundle of microfluidic channels was used with the reversible bonding strategy. This parallel multiplexing strategy was demonstrated with simultaneous detection of eight proteins in breast cancer cells and tissues. A new method of biomarker quantification based on co-staining of loading control (LC) protein in each microchannel area was proposed to reduce staining quality variations among the specimens and to compensate the variation of cell number and volume. Also, multi-concentration antibody (Ab) incubator was developed to reproduce Ab staining quality which is important for the standardization of quantitative assay in immunohistochemistry.
We demonstrated this quantum dot-based microfluidic multiple biomarker quantification (QD-MMBQ) method on cancer cells with utilization of β-actin as a LC. LC-based quantification showed the compensation effect of cell number and staining quality variation among specimens. β-actin normalization method was also demonstrated with clinical samples and enabled the quantification of multiple biomarkers. We also demonstrated that microfluidic blocking showed superior and controllable blocking effect compared to the conventional static incubation method. LC-based biomarker quantification was conducted on breast cancer tissues with cytokeratin, which is specialized LC for cancer tissues. To obtain the biomarker expressions only from the cancerous cells, the multiple channels were aligned onto the tissue area where epithelial cells are densely populated that is determined by previous cytokeratin staining. Three important breast cancer biomarkers were quantified with QD-based spectroscopic quantification system. The measured multiple biomarker expression of ten breast cancer patients was accurately correlated with the conventional scoring results which was previously determined by pathologists. This shows that our method can be compatible with conventional scoring method. Also, this method can be used for the compensation of cell number and staining quality variation among specimens as conducted in cell samples. A novel autofluorescence (AF)-removal algorithm was developed, which normalizes the reference AF spectra reconstructed from unknown AF spectra based on random sampling. For accurate quantification of QDs, we automatically and accurately removed the AF signal from 344 spots of QD-labeled tissue samples using 240 reference AF spectra. Using analytical data with ten tissue samples from breast cancer patients, the measured biomarker intensities were in good agreement with the results of conventional analyses.
We developed a novel Ab quality control system by using a microfluidics technology. A microfluidic multi-concentration Ab incubator was exploited to incubate Ab at linearly diluted several concentration points of Ab. For the linear dilution of Ab, a new design of microfluidic network structure is introduced which has simple and easy design but generates stable target concentration gradient by modifying the Christmas fluidic network. By observation of the Ab labeling tendency using a microfluidic multi-concentration Ab incubator, we found out that the staining intensity of batch Ab incubation results can be reproduced by our microfluidic system at various range of concentrations. This means that our system can be used for the quality validation of Ab in real field of pathology laboratories. We also designed a special cell microarray (CMA) for the efficient use of the multi-concentration Ab incubator. CMA contains representative cell lines of breast cancer, so positive and negative control of major breast cancer biomarkers can be screened simultaneously using CMA sections. Three HER2 Abs from different Ab producing companies were validated with our system by combining a multi-concentration Ab incubator and CMA sections. After the selection of the concentration point in which resulted in the most similar intensities of three Abs staining using a microfluidic device, 2 h batch Ab incubation was processed at selected concentration points for each Ab. The results showed that similar intensities can be reproduced in both of cells and human tissues.
다양한 암 분야에 걸쳐 수술, 방사능, 화학 치료에 더하여 특정 암 관련 분자를 목표로 하는 약품들이 개발되고 있으며, 이미 몇몇의 제품은 그 효과가 입증되어 FDA 승인까지 완료, 암 치료에 사용되고 있다. Herceptin이 그 중 가장 유명한 약품으로 주로 유방암 치료에 사용되는데, 이 약품에 사용하기 위해서는 HER2 단백질을 먼저 환자조직에서 정량 분석할 수 있어야 한다. 이와 같은 의미로, 현대의 암 진단에 있어서 면역조직화학법의 중요성은 해가 지날수록 커지고 있다.
암의 개인별 이질적 특성은 암의 완벽한 치료를 위해 더 많은 수의 바이오마커 분석을 요구하며, 이에 따라 최근 면역조직화학법 연구에서의 가장 큰 화두는 다중바이오마커 동시분석과 정량가능한 분석, 그리고 큰 집단연구에 필요한 분석방법의 표준화이다. 최근, 이와 같은 이슈들을 해결하기 위해 양자점을 이용하여 다중바이오마커 동시분석 및 바이오마커 정량을 위한 면역조직화학법이 많이 개발되고 있다. 하지만 적은 수의 바이오마커 동시분석능력, 표준화되지 않은 소프트웨어 기반 이미지 분석툴의 사용, 항체 LOT간 다른 결합력 등으로 인해 현재까지는 다중바이오마커의 정량분석 및 표준화 개발에는 한계가 있었다.
본 연구에서는 이와 같은 한계를 극복하고자 미세유체제어 기술과 양자점을 면역조직화학법에 이용하는 방법, 그리고 스펙트로스코픽 방법 등을 이용하여 많은 수의 바이오마커 동시분석, 효과적인 자가형광 신호의 제거 및 내부기준을 이용하는 바이오마커 정량분석법, 항체LOT간 결합력 차이로 인해 발생하는 염색정도 차이를 보정할 수 있는 시스템을 개발하였다.
첫 번째로, cytokeratin과 같이 상피세포에서 비교적 균일하게 발현되는 단백질을 이용하는 내부기준 바이오마커 정량분석법을 개발하였다. Cytokeratin을 내부기준으로 목표단백질과 함께 다른 색의 양자점으로 동시에 염색하고, 절대적인 정량분석이 가능하게끔 스펙트로미터로 신호를 획득하여 내부기준 신호로 목표단백질 신호를 노멀라이징하는 방법으로 비교정량분석을 실시하였다. 이 방법으로 유방암 세포주로 만들어진 암세포 샘플을 분석한 결과, 세포 수나 샘플의 질 등에 영향을 받지 않고 분석 가능한 것을 확인할 수 있었다. 유방암의 대표 바이오마커인 ER, PR, HER2 분석 등을 본 방법을 이용하여 유방암 환자조직에서 분석 시행한 결과, 병리학자가 판별한 점수 등과 동일하게 나오는 것을 확인할 수 있었다. 본 방법에서 사용된 자가형광 신호의 제거 개념은 기존 방법보다 더 뛰어날 수 있음을 확인할 수 있었다.
두 번째로, 항체LOT간 결합력 차이로 인해 발생할 수 있는 단백질 염색질의 편차를 줄여줄 수 있는 시스템을 개발하였다. 항체로 단백질을 염색할 때 그 염색의 진함 정도를 조절해 줄 수 있는 요소 중 농도 차이를 이용하여, 다른 결합력을 가지고 있는 항체라도 농도 조절을 통해 같은 염색 진함을 재현할 수 있는 시스템을 설계하였다. 본 시스템의 설계를 위해 먼저 선형적인 농도구배를 만들어 낼 수 있는 새로운 디자인의 마이크로칩을 개발하였다. 그리고 여러 종류의 유방암 세포주를 블록으로 제작하여 어레이에 배치하는 세포 마이크로어레이를 개발하였다. 개발된 마이크로어레이는 ER, PR, HER2 단백질의 비특이적 반응의 정도까지 측정할 수 있도록 제작되었다.
개발된 마이크로칩과 세포 마이크로어레이를 이용하여 3가지 HER2 항체를 염색해 본 결과, 기존 방법으로 특정시간 동안 염색한 결과와 본 시스템에서 염색한 결과를 다양한 농도 범위 내에서 동일하게 맞출 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 기반으로 3가지 항체의 염색 강도를 가장 비슷한 범위 내에서 맞추어 그 각각의 농도에서 기존 방법으로 염색을 진행한 결과, 비슷한 염색강도를 재현할 수 있음을 세포샘플과 환자샘플에서 보여주었다. 또한, 본 시스템을 이용하여 HER2 항체의 비특이적 반응의 정도 등을 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다.
