In this study, we propose the methods that overcomes the limitation of existing techniques to measure neuronal activity in-vivo. By utilizing them, the role of thalamic reticular nucleus in fear extinction is addressed.
1. The progress of measurement technique in neuroscience allows us to embody the experiments cannot be approached before. For example, the two-photon calcium imaging and the tetrode recording with microdrive are the techniques to record the single neuronal activity with large spatial resolution or high temporal resolution, which enables to get close to the answers for fundamental questions in neuroscience. However, despite the strong advantages, there are practical limitations to apply those techniques.
Although the two-photon microscopy is an excellent physiological technique that enables simultaneous record-ing of hundreds of brain cells in-vivo at a single-cell resolution, a precise targeting of cortical location is not easy for bulk-loading of calcium indicator due to its fine dimensionality. Here, we propose the new method, based on local field potential (LFP) recording, for precise targeting. The heart of this method lies in the use of the same glass pipette for recording LFP and for ejecting calcium dye. After confirming the target area by LFP using a glass pipette, calcium dye is ejected from the same glass pipette without time delay or spatial readjustment. As a result, calcium dye can be loaded to the exact same ensemble of brain cells from which the LFP was obtained. To demonstrate the validity and usefulness of our LFP-based method, we targeted the layer 2/3 of specific bar-rel column in the mouse somatosensory cortex. The result showed that the calcium dye was successfully loaded into the target barrel column, which indicates the proposed method provided precise targeting of small function-al structures such as a cortical functional column for two-photon calcium imaging in-vivo.
Recently, various studies using optogenetics have been performed in neuroscience. Although the optogenetic system allows us to modulate the neurons with a high temporal resolution, simultaneous recording with optical stimulation is not easy due to the mechanical limitations of recording device. We developed a simple way to make a microdrive which can also deliver the optical stimulation simultaneously with the electrophysiological recording, which is called “optical microdrive”. The microdrive originated from commercial manufacturer was modified to be equipped with the thin optical fiber of 125 $\mu$m diameter. The proposed method was validated by the electrophysiological recording accompanied with the optical stimulation in freely moving mice. The result showed that the time-locked single unit response to the optical stimulation, which indicates the proposed method provided successful in-vivo single unit recording with optical stimulation in freely moving mice.
2. We studied the function of the thalamic reticular nucleus (TRN) in fear extinction by utilizing one of the ad-vanced techniques, i.e., optical microdrive, to measure in-vivo neuronal activity.
First, we revealed the specific TRN sector which is related to the fear extinction. The retrograde tracer was in-jected into the area which is known to be a center for fear extinction, and the position of the labeled neurons in TRN was accessed. The result showed that the rostral sector of TRN projects to the center of fear extinction, which indicates that this specific sector might play an important role in fear extinction.
Second, we modulated the rostral sector of TRN with optogenetic methods during fear extinction learning. The channelrhodopsin-2 (ChR2) was specifically expressed in the parvalbumin-positive neurons in the rostral sector of TRN by injecting cre-dependent ChR2 virus into Pvalb-IRES-Cre mouse and the optical fibers were implant-ed to the rostral sector of TRN. The blue light stimulation during fear extinction learning resulted in significantly enhanced fear extinction learning and the lower freezing level in retrieval test of extinction.
Third, using optical microdrive, we recorded the single unit activity in the TRN in freely moving mice during fear extinction learning while the rostral sector of TRN was simultaneously modulated by optogenetic stimula-tion. Compared to the control group, which the optogenetic stimulation was not given to, the stimulated group showed the increased firing rate in TRN during the presentation of conditioned stimulus.
Combining anatomical, behavioral and electrophysiological assessment, our data showed that the rostral sec-tor of TRN is involved in fear extinction and the optogenetic modulation of TRN results in dramatic enhance-ment of fear extinction learning.
본 박사학위논문에서는 현존하는 생체 내 신경세포의 활동을 측정하는 기술들의 한계점을 극복하는 방법을 연구하였고, 이를 활용하여 공포기억소멸에 있어서의 시상그물핵의 역할을 밝혀내었다.
1. 신경과학에서 측정기술의 발달은 이전에는 실행하기 어려운 실험들을 가능하게 해주었다. 예를 들어, 투포톤 칼슘이미징과 마이크로 드라이브를 이용한 테트로드 레코딩 같은 기술은 여러 개의 개별 신경세포의 활동을 동시에 측정하거나 또는 매우 세밀한 시간단위로 측정 가능하게 해준다. 하지만, 이러한 장점에도 불구하고 이 기술들을 실제적으로 실험에 사용함에 있어서 해결해야 할 문제점들이 있다.
투포톤 칼슘이미징의 경우에, 여러 개의 신경세포로부터 칼슘 신호를 측정하기 위해서는 먼저 칼슘 염색약을 원하는 위치에 정확히 주입시켜야 한다. 현재는 고유 광 신호 측정법이라는 것을 사용하고 있으나, 수백 마이크로미터 정도의 작은 피질 지역에 정확히 주입하기에는 이 방법은 그 정확성이 충분하지 않다. 본 연구에서는 이를 해결할 수 있는 새로운 방법을 제시한다. 제시된 방법의 핵심은 칼슘 염색약 주입을 위해 사용되는 피펫을 전기신호도 동시에 측정 가능할 수 있도록 개조하여, 이 전기신호를 이용하여 표적지역을 정확하게 찾고, 그 지역에 칼슘 염색약을 정확히 주입하는 것이다. 이 방법을 이용하여 생쥐의 특정 배럴 컬럼 피질을 대상으로 검증을 하였고, 측정된 칼슘 신호를 확인한 결과, 의도한 배럴 컬럼 피질에 칼슘 염색약이 정확히 주입된 것을 보여주었다.
광유전학은 특정 종류의 신경세포를 원하는 시간에 정확히 활성화시킬 수 있는 장점이 있다. 다만 살아있는 쥐에서 광유전학을 이용하여 개별 세포의 활동을 측정하는 것은 측정장비의 한계점으로 인해 쉽지 않다. 마우스와 같은 두개골 표면이 작은 동물의 경우, 기존에 널리 쓰이는 마이크로 드라이브와 광섬유를 동시에 두개골 위에 심는 것은 공간상의 문제로 쉽지 않다. 본 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 마이크로드라이브에 광섬유를 이식하여 쉽게 위의 문제점을 해결하는 방법을 제시한다. 이 방법을 이용하여 살아있는 생쥐에서 광자극과 함께 개별 신경세포의 활동을 성공적으로 측정함으로써 제안된 방법의 유효성을 검증하였다.
2. 본 연구에서는 또한 위의 발전된 생체 내 신경세포 활동 측정 기술을 이용하여 공포기억 소멸에 있어서의 시상그물핵의 역할에 대해 규명하였다. 시상그물핵은 기존에 감각신호 차단, 집중, 수면등에 연관되어 많은 연구가 이루어진 지역이다. 최근 시상그물핵이 공포와 같은 감정에도 영향을 미칠 가능성이 있다는 보고가 있지만, 이에 대한 자세한 연구는 이루어 지지 않았다. 본 연구는 공포기억소멸에 있어서 시상그물핵의 역할을 조직학적, 행동실험적 그리고 전기생리적 접근으로 살펴보았다. 먼저, 공포기억소멸과 관련이 있을 시상그물핵의 세부지역을 찾아내기 위해, 생쥐의 시상그물핵 지역 중, 기존에 공포기억소멸과 관련이 있다고 알려진 지역과 조직학적 연결을 가지고 있는 지역을 조사하였고, 이 부분이 시상그물핵의 전측 부분이라는 것을 알 수 있었다. 광유전학적인 방법을 이용하여, 공포기억소멸 학습과정 동안 이 부위를 인위적으로 자극한 결과, 공포기억소멸 학습이 강화되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 이 지역의 개별 신경세포의 활동이 학습과정 중 유의미하게 증가되는 것이 관찰되었고, 광자극에 의해 이 현상이 더욱 증폭되었음을 알 수 있었다. 종합하여 볼 때, 전측 시상그물핵은 공포기억소멸에 깊은 관여를 하고 있으며, 이 부위의 광자극은 개별 신경세포의 활동을 증가시킴으로써 공포기억소멸 학습을 강화시킨다는 것을 알 수 있었다.
