For intravital real-time imaging of fast dynamic behaviors of various cells in lymph node and small intestine, a video-rate laser scanning confocal microscopy system was built based on previous reported platform. The custom-built confocal microscope system was capable of obtaining sub-micron resolution images at 30 frame/sec including three colors.
Lymph node (LN) is a major checkpoint for the circulating lymphocytes to recognize foreign antigens. High endothelial venule (HEV) in LN facilitates an effective recruitment of circulating lymphocytes (mainly T and B cells) from the blood. HEV has distinctive cuboidal-shaped endothelial cells and prominent perivascular sheaths consisting of fibro-reticular cells (FRCs). There have been many efforts to visualize lymphocytes trafficking across HEV to understand the underlying mechanism. However, due to insufficient spatiotem-poral resolution and the lack of an in vivo labeling method, clear visualization of dynamic behaviors of rap-idly flowing lymphocytes in HEV has been difficult. In addition, transendothelial, intra-perivascular channel and trans-FRCs migration of T and B cells in HEV has been poorly understood yet.
In this work, I clearly visualized rapidly flowing T cells in HEV real-time in vivo by utilizing the custom-built confocal microscopy system. Fast dynamics of T cells interacting with HEV-endothelial cells were analyzed compared with RBCs by generating velocity colormaps. I also demonstrated that the endothelial cells and the FRCs in HEV can be fluorescently labeled in vivo by injection of anti-CD31 antibody and anti-ER-TR7 anti-body conjugated with Alexa Flour, respectively. Actin-DsRed transgenic mouse can be also used to visualize HEV-endothelial cells that highly express DsRed fluorescent protein compared with stromal cells and lym-phocytes. The antibody based in vivo labeling methods and Actin-DsRed mice enable the clear visualization of whole migration of GFP-expressing T and B cells in HEV including transendothelial migration, crawling in perivascular channel and trans-FRC migration. Interestingly, compared with T cells, B cells spent longer time in passing the perivascular channel although their total moving distances in the perivascular channel were similar. By time-lapse imaging during 2 hours, I also found there were preferred exit sites (“exit ramp”) from the perivascular channel for both of T and B cell. Indeed, T and B cells followed each other through the same exit ramp from the perivascular channel. In addition to the exit ramp, there existed an “entrance ramp” to perivascular channel, a preferred site for transendothelial migration for both of T and B cells.
Small intestine is a major organ in which digestion and absorption of nutrients actively occur. The luminal surface of the small intestine is densely covered with villi, which provide an extensive absorptive surface area. At the surface of each villus, enterocytes absorb the majority of digested and processed nutrients and materi-als, including drugs, across the apical membrane and release them into the lamina propria. Lacteals are lym-phatic vessels located at the center of each villus and provide essential transport routes for lipids and other lipophilic molecules. However, the dynamic process for the absorption and transport of lipids from villus en-terocytes to lacteals has been poorly understood in vivo, mostly because of the lack of appropriate experi-mental tools.
Here, I used reporter mice that express GFP under the control of the lymphatic-specific promoter Prox1 and the custom-built confocal microscope and performed intravital real-time visualization of the absorption and transport dynamics of fluorescence-tagged fatty acids (FAs) and various exogenous molecules in the intesti-nal villi in vivo. These analyses clearly revealed transepithelial absorption of these molecules via enterocytes, diffusive distribution over the lamina propria, and subsequent transport through lacteals. Moreover, I ob-served active contraction of lacteals, which seemed to be directly involved in dietary lipid drainage. Quantita-tive analysis revealed that the smooth muscles that surround each lacteal are responsible for contractile dy-namics and that lacteal contraction is ultimately controlled by the autonomic nervous system. These results indicate that the lacteal is a unique organ-specific lymphatic system and does not merely serve as a passive conduit but as an active pump that transports lipids. Collectively, using this efficient imaging method, this study uncovered drainage of absorbed molecules in small intestinal villus lacteals and the involvement of lacteal contractibility.
생체 내 영상화는 기존에 생명연구에 주로 사용하던 ex vivo, in vitro 방법의 한계를 넘어 가장 생리적 환경에 근접한 조건에서 세포들의 역동적인 움직임을 장시간 관찰 할 수 있는 방법이다. 최근에는 고해상도 고속의 광학현미경, 다양한 형광표지기법, 체내 장기를 관찰 할 수 있는 영상챔버 및 내시경장비의 개발로 생체 내 영상화를 이용한 다양한 생명연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 마이크로 단위 보다 작은 고해상도와 초당 30장의 3색 이미지를 획득 할 수 있는 초고속의 공초점 현미경을 자체 제작하고, 생체 내 림프절 및 소장에 존재하는 특정 세포들의 형광 표지기법을 수립하여, 역동적인 세포들 간의 상호작용을 관찰하였다.
림프절(lymph node)은 전신에 퍼져있는 면역감시기관으로서, 내외부에서 발생하는 이물질, 즉 잠재적 항원을 걸러내는 거름망 역할을 한다. 림프관을 통해 림프절로 모인 항원은 항원표출세포(antigen presenting cell)에 의해 처리되어 T세포에 제시된다. 극도로 다양한 항원에 적절히 대응하기 위해서는 다양한 항원 특이적 T세포들이 전신에 산재한 림프절을 지속적으로 순환하여야 한다. 림프절에서 빠져 나와 혈류로 유입된 T세포는 평균적으로 30분 이내에 동일한 또는 다른 림프절로 유입된다. 혈류 내 T세포를 효과적으로 모으기 위해서 림프절 내에는 HEV(high endothelial venule)라는 특이적인 정맥 구조가 존재하는데, 다양한 혈액세포들 중에 T세포를 포함한 림프구(lymphocyte)만 특이적으로 통과시킨다. 평평한 모양의 일반적인 혈관내피세포(endothelial cell)와 비교하여, HEV는 분명히 구분되는 부풀어 오른 장방형태(cuboidal shape) 내피세포를 가지며, 섬유모세포형 망상세포(fibroblastic reticular cell, FRC)로 둘러 쌓여있다. 혈액 내를 빠르게 순환하던 T세포가 HEV 내피세포를 통과한 후, FRC를 통과해야 비로소 림프절 내로 성공적으로 들어오게 된다. 지난 이십 년간, 혈액 내 T세포와 HEV 내피세포 간에 상호작용 및 관련 접합분자(adhesion molecule)에 대한 연구가 생체 내 영상화 기술로 활발히 이루어졌다. 그러나, 혈액 내를 빠르게 순환하는 T세포가 HEV의 내피세포로 접근하여, 림프절 유입을 위한 초기 결합을 달성하는 과정은 기존영상기술의 영상획득속도의 한계 및 적절한 형광표지방법의 미비로 인해 연구되지 못했다. 또한, T세포가HEV 내피세포를 통과하는 과정과 이후FRC로 둘러 쌓인 좁은 공간(perivascular channel)을 빠져 나오는 과정에 대한 이해는 상대적으로 부족하다. 그리고 T세포에 비해 B세포의 유입과정에 대한 연구가 부족하다.
본 연구에서 자체 제작한 고해상도 초고속 공초점 현미경을 이용하여, 살아있는 생쥐의 림프절 내 HEV의 혈관내피세포와 T세포의 상호작용을 실시간으로 영상화하였다. Alexa Flour라는 형광물질이 부착된anti-CD31 항체와 anti-ER-TR7 항체를 생쥐에 주입하여 각각 혈관내피세포 와 섬유모세포형 망상세포를 염색하였다. 또한, Actin-DsRed 유전자 변형 생쥐의 HEV 혈관내피세포에서 강하게 적색형광단백질(DsRed)이 발현되는 것을 발견하고, 장시간 영상화하는데 사용하였다. 이러한 항체기반 생체 내 염색기법과 유전자 변형 생쥐를 이용하여, T와 B 세포가 HEV를 통과하는 전체 과정을 세밀히 관찰 할 수 있었다. 먼저, T 세포가 모세혈관에서 HEV로 유입될 때 일어나는 초기결합 과정을 시공간적 속도 분포를 나타낼 수 있는 colormap으로 분석하여, 적혈구의 속도 분포와 비교하였다. 그리고 perivascular channel을 빠져 나오는데 T세포에 비해 B세포가 현저하게 느리다는 것을 발견하였다. 기존에 보고된 것과 같이, T 세포가 perivascular channel을 무작위 위치에서 빠져 나오는 것이 아니라 특정 선호 지점에서 연속적으로 빠져 나오는 것을 관찰하였다. 또한, 기존에 보고되지 않은 B 세포에 대해서도 비슷한 현상을 발견하였으며, T세포와 B세포가 같은 위치에서 빠져 나오는 것을 확인하였다.
소장(small intestine)은 위와 대장 사이에 위치한 긴 관 형태의 장기로 일상적으로 섭취하는 대부분의 음식을 소화 및 흡수한다. 소장 내벽은 융모(villus)라고 하는 돌기형태의 구조물로 덥혀 있어서, 소화된 영양분이 닿는 면적을 증가시켜 효과적인 영양흡수를 돕는다. 융모 표면을 구성하고 있는 장상피세포(enterocyte)는 소화된 영양분 및 약물을 흡수하여 융모 내부로 분비한다. 장상피세포를 통과한 지방 및 지용성 물질은 융모 내부 중앙에 위치한 말단 림프관인 암죽관(lacteal)에 흡수되어 장간막 림프관(mesenteric lymphatic vessel)을 거쳐 체순환계로 유입된다. 대부분 융모의 내부 혈관으로 흡수되어 간문맥(portal vein)을 통해 간으로 바로 흡수되는 수용성 약물과는 달리, 지방과 함께 림프관으로 흡수되는 지용성 약물은 간에서 일어나는 대사작용(first-pass metabolism)을 피할 수 있어서 약물의 효율을 높일 수 있다. 이러한 약물의 림프관흡수가 새로운 효과적인 약물전달시스템 개발전략으로써 충분한 가능성을 갖고 있음에도 불구하고, 생체 내 소장 영상화기법의 부재로 인해 지방의 림프관흡수과정 조차도 이해가 부족한 실정이다.
본 연구에서는 자체 제작한 소장영상화챔버와 고해상도 초고속 공초점 현미경을 이용하여, 살아있는 생쥐의 소장 내벽에서 지방의 흡수과정을 영상화하였다. 생체 내 형광염색 방법으로, 림프관 특이 유전자인 Prox1에서 녹색형광단백질(GFP)가 발현하는 유전자 변형 생쥐와 적색형광물질(BODIPY)이 부착된 지방산을 이용하였다. 지방산이 융모 표면의 장상피세포에 먼저 흡수되고, 이후 융모 내부로 고르게 퍼져 중앙에 위치한 암죽관으로 흡수됨을 관찰하였다. 지방산 이외에도 다양한 화학적 특성을 가진 형광물질 및 약물의 흡수를 관찰하였다. 그리고 예상치 못한 암죽관의 반복적인 수축과 이완 현상을 발견하였다. 암죽관의 수축 정도가 소장에서의 지방산 흡수 속도에 영양을 미치는 것을 발견하였다. 또한 이 암죽관의 움직임이 융모 내부에 다량 존재하는 민무늬근세포에 의해 발생되고, 이는 체내에 분포된 자율신경계를 통해 조절됨을 밝혔다. 이 결과는 기존에 알려져 있던 말단 림프관의 수동적 조직액 흡수 기능과 다른 능동적 흡수 및 전달 능력이 암죽관에 있음을 시사한다.
