CitS is a member of 2-hydroxycarboxylate transporters and has been extensively studied for more than two decades. It imports two sodium ions and a citrate molecule from outside of the cell. CitS is known to exist as a dimer and each monomer is composed of the N- and C-terminal domains whose structures are related by two-fold pseudo-symmetry. CitS contains 11 transmembrane alpha helices and two re-entrant loops that are indispensable for substrate transportation. Similar with many transmembrane proteins, crystallographic study of CitS has been hampered by hydrophobic nature of the protein. In order to overcome this problem, I have developed a novel method that can improve crystallization property of CitS. Diabodies are bispecific antibody fragments that are composed of two Fv domains. Using previously reported structures of antibodies against CitS and human TLR3, I designed a diabody that can simultaneously interact with CitS and TLR3. The resulting diabody can make a stable complex with CitS and TLR3 that can be crystallized in a buffer containing PEG4000. In order to improve diffraction limit of the CitS-diabody-TLR3 crystals, diverse set of detergents have been tested. Among them, I found that Cymal 7 could substantially improve diffraction limit of the crystals. Careful optimization of dehydration condition of the crystals greatly improved diffraction limit of the crystal presumably by reducing solvent content of the crystals. To further improve x-ray diffraction, I have introduced a disulfide bridge between two heavy chains of the diabody. The disulfide bridge can have significant impact in the crystal packing because it can modulate the angle between the two heavy chains of the diabody. Several amino acid pairs that can form disulfide bridges were chosen using the known crystal structures of the antibodies and mutated to cysteines. Among them, the disulfide bridge made by mutations of T87C of anti-CitS and S88C of anti-hTLR3 produced the best crystals that can diffract x-ray beyond 2.3 $\AA$.
Secondary transporter는 세포가 필요로 하는 영양분이나 이온을 세포 안으로 이동시키거나, 세포내에서 생성된 물질이나 독성이 있는 물질을 외부로 수송하는데 관여하며, 이때 원래 존재하는 물질의 농도 차이을 통해 농도구배의 반대로 물질을 이동시킨다. 박테리아에서 발현되는 2-hydroxycarboxylate transporter는 secondary transporter의 한 종류로, 2- hydroxycarboxylate 모티프를 가지는 물질의 이동에 관여한다. CitS는 나트륨 이온에 의존성을 가지는 citrate carrier로써, 가장 많이 연구 되어진 2-hydroxycarboxylate transporter의 한 종류이다. CitS는 총 11개의막을 관통하는 헬릭스 구조을 가지는데 의대칭 관계에 있는 N-term 도메인과 C-term 도메인으로 나뉘어진다. 각각의 도메인에는 5개의 막을 관통하는 나선 구조와 1개의 막 안쪽으로 굽은 루프 구조를 가지며, 이 루프 구조가 citrate 물질의 이동에 관여하는 것으로 알려져 있다.
그동안 CitS의 구조를 밝히기 위해 많은 노력이 있었으나, 막 단백질이 가지는 수소성 특징때문에 결정화에 어려움이 많았다. 막단백질의 이러한 단점을 해결하기 위해 사람들은 여러 방법을 고안했는데, 크게 막단백질의 소수성 특징을 이용하는 방법과, 막단백질에 친수성을 가지는 부분을 늘려주는 방법이 있다. Lipid cubic phase와 bicelle이 소수성 특징을 이용하는 방법으로, CitS에도 이 방법을 이용해보았다. 하지만 크게 효과적이지 않았다. 두번째로 막단백에 친수성을 갖는 부분을 늘려주는 방식은 유연성을 가지는 루프 구조를 수용성의 단백질로 치환하는 방법과 항체를 이용하는 방식이다. 치환의 방식은 루프의 바운더리를 확정하는 것이 쉽지 않고, CitS의 경우 ankyrin 단백질을 이용해 보았으나, 발현이 잘 되지 않았다. 항체를 이용한 경우, 결정화에는 성공하였으나, 고해상도의 회절 데이터를 얻을 수 없었다. 이에 이중특이항체인 diabody를 이용하였다. Diabody는 두 종류의 항체를 이용해 이중특이성을 갖기 때문에 CitS뿐만 아니라 반대쪽에 다른 단단하고 친수성을 갖는 단백질을 연결, 결정화에 중요한 친수성 패킹에 도움을 줄 수 있다. 이미 알려진 항체를 이용해 다양한 파트너를 이용, 결정화를 시도해보았고, human TLR3에 특이성을 가지는 diabody을 이용한 경우, 안정적인 복합체를 만드는 데 성공했고, PEG 4000 조건에서 결정화에도 성공하였다. 하지만 고해상도의 회절 데이터를 얻을 수 없었다. 결정을 개선시키기 위해 여러가지 조건의 변화를 주었다. 먼저, 막단백질의 안정화에 필요한 detergent의 종류를 바꿔보았고, 기존의 DDM에서 Cymal7으로 바꾼 경우, 결정의 회절 정도가 향상되는 것을 확인하였다. 또한 dehydration방법을 이용, 결정내의 용제의 양을 줄여, 결정의 패킹을 더 견고하게 해주었다. 그럼에도 불구하고, 회절 데이터는 비등방성을 보였고, 구조 규명에 필요한 고해상의 회절 데이터를 얻을 수 없었다.
고해상도의 회절 데이터를 얻기 위해서는 더 견고한 구조를 가지는 결정이 필요했기 때문에, diabody의heavy chain사이의 disulfide bridge을 넣어서 diabody 사이의 각도를 조절, 견고한 구조를 갖는 diabody을 만들어서 복합체의 형성에 사용하였다. CitS 특이성의 heavy chain의 87 Thr과 hTLR3 특이성의 heavy chain의 88 Ser을 cysteine으로 변화시킨 diabody을 사용한 CitS의 복합체는 PEG 5000 MME조건에서 결정을 얻을 수 있었으며, 이 결정은 2.3 $\AA$의 해상도로 회절하였다.
