The GSK3-$\beta$ kinase is linked to many kinds of cancer either as a tumor suppressor or as a tumor promoter. Genomic instability is one of the underlying hallmarks for tumor initiation. The link between GSK3-$\beta$ and genomic instability is still unclear. In the perspective of tumor development and progression, mutations are believed to accumulate due to compromised DNA repair. Using yeast genetics as a powerful tool, we discovered Rim11, the human GSK3-$\beta$ homolog as a suppressor of dna2 and rad18 mutants. Dna2 is an essential endonuclease/helicase in Okazaki fragments synthesis, whereas Rad18 is an E3 ubiquitin ligase responsible for activating the post-replication repair (PRR). Overexpression of Rim11 kinase suppressed the lethality of dna2 helicase-dead mutant and the methyl methane sulfonate (MMS) sensitivity of rad18 null mutant. The substrate for Rim11 responsible for the suppression is Ume6, a DNA binding protein. Ume6 interacts with the histone deacetylase complex (HDAC) Sin3/Rpd3, and this interaction and the deacetylase activity of Rpd3 are necessary for the Rim11-dependent suppression of dna2 mutant. Through epistatic analysis we showed that the Rim11-initiated suppression of dna2 and rad18 mutants promotes sister-chromatids recombination (SCR) mediated by the Rad52/Rad59 proteins. In support of this, both dna2 and rad18 mutants could be rescued by the overexpression of Rad52. Moreover, we found that checkpoint arrest is heavily enforced in dna2 mutant. Checkpoint could impose restriction on recombination-mediated repair. As previously reported Rpd3-mediated deacetylation of Rad53 facilitates in suppressing the activation of checkpoint. We asked whether the role of Rpd3 is to suppress checkpoint therefore allowing HR repair. Indeed, the removal of key checkpoint proteins like Rad9 or Rad53; or overexpression of ribonucleotide reductase inhibitor Sml1 allowed cells with dna2 mutation to be viable.
Our data demonstrate that GSK3-$\beta$ homolog Rim11 is directly involved in repair of faults in Okazaki fragment synthesis, by promoting homologous recombination through suppression checkpoint activation, revealing a novel pathway of post-replication repair (PRR) that is distinct from the well-described Rad6-Rad18 pathways. Our finding could explain why GSK3-$\beta$ promote cell proliferation and tumor growth and explain why down regulating GSK3-$\beta$ is beneficial in cancer therapy. The elevated levels of GSK3-$\beta$ could allow tumor cells to easily overcome replicative stress by facilitating DNA repair in cancer.
종양이 발생하고 증식하는 동안, 세포 내부에서는 DNA 수선 과정 결함으로 돌연변이가 축적된다고 여겨지고 있다. 종양 억제인자 혹은 촉진 인자로써 GSK3-$\beta$ kinase는 많은 종류의 암들과 연관되어 있다. 유전체 불안정성은 암 발생 단계의 중요 특징들 중 하나인데, GSK3-$\beta$ kinase와 유전체 불안정성의 관계는 아직 확실치 않는 상태로 남아 있다. 우린 효모 유전학이란 강력한 연구 수단을 통해 dna2와 rad18 돌연변이의 억제 인자인자 Rim11를 발견했는데, 이는 인간 GSK3-$\beta$ kinase의 동종 단백질이다.
Dna2는 오카자키 조각 합성에 필수적인 endonuclease/helicase로인 가운데, Rad18은 복제 후 수선 (post-replication repair, PRR) 경로를 활성화시키는데 있어서 중요한 E3 ubiquitin ligase이다. Rim11 kinase의 과다 발현은 dna2 helicase-dead 돌연변이의 치사성을 억제하는 가운데 rad18 삭제 돌연변이의 methyl methane sulfonate (MMS) 민감성도 억제한다. 관찰된 억제 효과의 원인인 Rim11의 기질 대상인 Ume6인데, 이 DNA 부착 단백질은 히스톤 탈아세틸화 복합체 (Histone Deacetylation complex, HDAC)인 Sin3/Rpd3과 상호작용하고, 이 상호작용과 Rpd3의 탈아세틸화 작용은 Rim11에 의한 dna2 돌연변이의 억제에 필수적이다. Epistatic 분석을 통해 우리는 Rim11에 의한 dna2와 rad18 돌연변이의 억제가 Rad52/Rad59에 의한 염색분체 재조합 (sister-chromatids recombination, SCR)를 촉진한다는 것을 보여주었는데, dna2와 rad18 돌연변이 세포들 모두 Rad52 과다발현에 의해 구조될 수 있다는 점은 이를 뒷받침한다. 그 뿐만 아니라 우린 dna2 돌연변이 세포들에서 세포주기 체크포인트에 의한 정지가 강하게 일어난다는 것을 발견했는데, 체크포인트는 재조합에 의한 수선에 제한을 둘 수 있다는 점에 우리는 초점을 맞추었다. 전에 보고되었듯이, Rpd3에 의한 Rad53의 탈아세틸화는 체크포인트 활성을 억제하는 것을 촉진하고, 그러기 때문에 우리는 Rpd3의 역할이 상동재조합을 통한 수선이 가능케 하기 위해 체크포인트를 억제하는 것인지에 대한 여부를 확인했는데, 예상대로 Rad9이나 Rad53과 같은 핵심 체크포인트 단백질들의 제거 혹은 ribonucleotide reductase inhibitor인 SmI1의 과다발현은 dna2 돌연변이를 가진 세포들이 생존 가능케 했다.
우리의 실험 데이터는 GSK3-$\beta$ 동종단백질인 Rim11이 오카자키 조각 합성 시 발생한 오류들을 수선하는 데 직접적으로 관여하고 이는 체크포인트 활성 억제를 통한 상동재조합을 촉진함을 통한다는 것을 보여주었는데, 그 결과 우리의 연구는 지금까지 상세히 기술되어 온 Rad6-Rad18 경로와 뚜렷하게 구별되는 새로운 PRR 경로를 드러내었다. 우리의 발견은 왜 GSK3-$\beta$가 세포 증식과 종양 성장을 촉진하는지를 설명할 수 있는데, 세포 내 GSK3-$\beta$ 레벨 증가는 종양세포 내에서 DNA 수선을 촉진함으로써 종양 세포가 복제 스트레스를 쉽게 극복하도록 만들어 줄 것이다. 이는 또한 GSK3-의 억제가 왜 암 치료에 이득이 될 수 있다는 점을 시사한다.
