Escherichia coli strain was metabolically engineered to synthesize poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate [P(3HB-co-3HV)] using citramalate pathway derived 2-ketobutyrate, as a precursor for propionyl-CoA. Two different metabolic pathways for the production of propionyl-CoA from 2-ketobutyrate were constructed. The first one is composed of Dickeya dadantii 3937 2-ketobutyrate oxidase (2KO) or E. coli pyruvate oxidase mutant (PoxB V380A L253F) for the conversion of 2-ketobutyrate into propionate and Ralstonia eutropha propionyl-CoA synthetase (PrpE) for further activation of propionate into propionyl-CoA. Second one is consisted of E. coli 2-ketobutyate synthases (TdcE) or Clostridium difficile (PflB) for direct conversion of 2-ketobutyrate into propionyl-CoA The recombinant E. coli XL1-Blue strain equipped with citramalate pathway harboring E. coli poxB V380A L253F and R. eutropha prpE genes together with R. eutropha PHA biosynthesis genes successfully produced P(3HB-co-2.3mol%3HV) up to 61.7 wt% of polymer content . Also, further increased 3HV fraction up to 5.5 mol% was achieved by deletion of the prpC and scpC genes.
E. coli XL1-Blue strain was engineered to produce aromatic monomer, phenyllactic acid in E. coli XL1-Blue strain. First, the negative feedback inhibition of key enzyme such as aroF and pheA was released by site directed mutagenesis. Second, tolerance test to know how much concentration of 5-phenyllactic, E. coli can tolerate, tolerance test was conducted using 0, 1, 5, 7 g/L of phenyllactic acid. The cell growth was dramatically inhibited by addition of phenyllactic acid in a dose dependent manner and cell was lysed more than 7 g/L of phenyllactic acid. Based on previous result and report, essential genes for amplification of shikimate and phenyllactic acid production was introduced in the E. coli XL1-Blue strain, resulting in 17 mg/L of phenyllactic acid production in MR medium. This study demonstrates the possibility for the biosynthesis of aliphatic and aromatic PHA from biomass.
지구온난화와 같은 환경문제와 원유 고갈 등의 문제로 인해 바이오매스를 기반으로한 바이오 산업에 대한 관심이 높아지고 있으며, 그에 따라 지속가능한 바이오 기반의 생분해성 재료가 석유기반의 고분자의 대체 재료로써 대두되고 있다.
폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)는 미생물에 축적되는 대표적 생분해성 고분자로 이들의 생체적합성과 구조적 안정성과 같은 뛰어난 물성으로 인해 산업적으로나 생의학적으로 널리 사용되어왔다. 그 중 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV)]는 다른 고분자에 비해 낮은 녹는점과 높은 유연성을 갖기 때문에 중요한 고분자로 알려져 있지만, 생물학적 방법을 이용한P(3HB-co-3HV) 생산을 위해서는 외부에서 고분자 전구체를 제공 해야만 가능하였다. 하지만 이러한 방법은 세포 성장과 P(3HB-co-3HV) 생산의 불균형을 초래 할 뿐 아니라, 단량체의 비율을 조절 할 수 없다는 단점이 있어 매우 비효율적인 방법이라 할 수 있다. 따라서, 이를 해결 하고자 대장균의 유전체를 대사공학적 방법으로 engineering 하여, 단량체의 비율을 조절 할 수 있는 방법을 개발하였다. 이를 위하여 2-ketobutyrate로부터 propionyl-CoA를 생합성 하기 위한 두 종류의 다른 대사경로를 구축하였다. 그 첫번째 대사회로 구축을 위하여, 2-ketobutryate로부터 propionate의 생합성을 위해 Dickeya dadantii 3937 유래의 2-ketobutyrate oxidase (2KO) 와 대장균유래의 pyruvate oxidase mutant (PoxB V380A L253F)를 비교하였고, propionate를 propionyl-CoA로 활성화 하기 위한 Ralstonia eutropha propionyl-CoA synthetase (PrpE) 및 대장균유래의 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase (AtoDA)를 비교하였다. 다음으로, 2-ketobutyrate로부터 propionyl-CoA로의 직접적인 전환을 위해 2-ketobutyate synthases (TdcE) 및 Clostridium difficile (PflB) 를 각각 증폭하였다. 최종적으로 선정된 poxBAF, prpE 유전자 및 cimA, leuBCD, phaCAB 유전자를 증폭한 결과, P(3HB-co-2.3mol%3HV)의 생합성을 확인하였다. 또한, 3-Hydoryvalerate (3HV)의 전구체인propionyl-CoA의 양을 늘리기 위해 경쟁 대사경로에 포함된 prpC 와 scpC 유전자를 결실하였으며, 최종적으로 5.5 mol%까지 3HV의 함량이 증가시키는 것에 성공하였다.
다음으로, 바이오매스에 기반을 둔 생물학적 방법을 통한 방향족 화합물 및 폴리머 생합성에 관해 연구를 수행하였다. Phenyllactic acid는 antimicrobial 화합물로서 다양한 의약품에 널리 사용되는 화합물의 전구체로 매우 중요한 화합물이다. 또한, 2-hydroxy계열의 화합물로써 고분자 생산의 전구체로 이용될 수 있다. Phenyllactic acid 생산을 위한 대사회로 설계를 위하여, 방향족 아미노산인 L-tyrosine, L-phenylalanine등에 의해 활성 억제를 받는 aroF, pheA 에 대하여 유전자 재조합 기술을 이용하여 활성 억제 (negative feedback inhibition)를 제거 하였다. 대장균에 총 9종의 유전자(aroFfbr, tyrA, tktA, ppsA, aroA, aroB, aroC, aroL, fldH)를 증폭하여 실험을 진행한 결과 17 mg/L의 phenyllactic acid 생합성에 성공하였으며, Pseudomonas oleovorans를 통한 P(3-hyroxyoctanoate-co-3-hyroxy-5-phenylvalerate)의 생합성도 성공하였다.
본 연구에서는 대사공학적 기법을 이용하여 단량체 비율의 조절이 가능한 지방족 고분자인 P(3HB-co-3HV)의 생합성에 성공하였고, 이러한 연구는 향후 다양한 공중합체의 단량체 비율 조절에 응용할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 방향족 고분자의 단량체로 이용될 수 있는 phenyllactic acid를 glucose로부터 생합성 하는 것에 성공하였고, 방향족 고분자 또한 생물학적 방법으로 생산에 성공하였다. 이로써, 대사공학적 기법을 통한 방향족을 포함한 다양한 종류의 폴리머 생산이 가능함을 검증하였고 (proof-of-concept), 이러한 결과는 미생물을 이용한 폴리머 생산 및 다양한 화합물 생산에 적극 활용될 수 있을 것이다.
