Since the majority of aromatic chemicals are currently manufactured employing petroleum as the raw material, development of alternate sustainable production methods have been a driving force. In this study, Escherichia coli was metabolically engineered for the production of phenol and anthranilic acid. For phenol production, I examined 18 E. coli strains with respect to their precursor production, product tolerance, and enzyme activity in search for the host strain for phenol production by introducing tyrosine phenol-lyase(tpl). Among the strains, engineering E. coli BL21 showed the highest phenol tier in flask culture and produced 1.69 g/L of phenol in fed-batch cultures. To solve the toxicity problem, two-phase extractive fermentation was performed and then produced 5.62 g/L of phenol finally.
W3110trpD9923 which revealed a nonsense mutation in the trpD gene, showed the probability to accumulate anthranilic acid by the loss of anthranilic acid phosphoribosyl transferase activity, but maintain anthranilic acid synthase activity. The effects of expressing genes of $aroG^{fbr}$, tktA, ppsA, aroK and aroC were evaluated. In shake flask experiments with minimal medium, strains W3110trpD9923/pAnt-G and W3110trpD9923/pAnt2 displayed the best production parameters, accumulating 1.07 - 1.13 g/L of anthranilic acid.
대사공학적 기법을 적용하여 친환경적으로 방향족 화합물인 페놀과 안트라닐산염의 생산 가능한 균주를 개발하였다. 페놀 생산을 위한 합성 대사회로 구축을 위해 페놀 생합성 효소(tyrosine phenol-lyase)를 도입하고, 이를 18종의 대장균에 적용하여 페놀 생산량을 분석하였다. 18종 대장균의 페놀 생산량은 0부터 420mg/L까지 분포하였다. 또한 대장균 종 사이의 페놀 생산량 차이를 설명하기 위해 플라스크 배양 상에서의 최고 생장량과 페놀의 전구체인 타이로신(Tyrosine) 생산량, 페놀에 대한 내성, 그리고 TPL의 활성을 측정하였다. 유전자 조작을 통해 개발 된 18 종의 대장균 중에서, BL21 균주가 유가식 발효를 통해 1.69 g/L의 페놀을 생산하였다. 더 나아가 페놀의 독성 문제를 해결하여 더 높은 타이터(titer)의 페놀을 생산하기 위해, glyceryl tributyrate를 이용한 Two-phase 유가식 발효를 진행였고, 그 결과 5.62 g/L의 페놀을 생산하였다. 이는 용매-내성균주인 Pseudomonas putida 를 유전자조작 기법을 통하여 개발한 페놀 균주와 비교하여, 유가식 발효에서는 3.6배, two-phase 유가식 발효에서는 6.5배의 높은 생산량이다.
안트라닐산염을 생산하기 위해서 안트라닐산염을 프레펜산(Prephenate)으로 전환시키는 trpD(anthranilic acid phosphoribosyl transferase) 유전자를 결실시키고 안트라닐산염 합성효소(anthran ilic acid synthase)의 활성은 그대로 유지된 돌연변이 균종(W3110trpD9923)을 사용하였다. W3110trpD9923 를 바탕으로 안트라닐산염의 대사흐름을 강화시키고 PEP와 E4P 의 양을 늘리기 위하여 3-deoxy-D-arabino-heptulosenate-7-phospha te synthase ($aroG^{fbr}$)와 transketolase (tktA), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), shikimate kinase I(aroK), 그리고 chorismate synthase (aroC) 유전자를 과발현시켜 줌으로써 안트라닐산염 생산량을 1.13 g/L 까지 증대시켰다.
