Our concerns are increasing about environmental pollution by solid wastes which are generally composed of non-biodegradable materials such as households and biomedical sources. Thus, there has recently been much interest in bio-based process for the production of industrial valuable materials from renewable resources. In this study, two independent researches have been carried out to produce biopolymers (PLA, PLGA) from genetically engineered microorganisms. Firstly, JLXF5 strain was engineered to express pPhaP437540 or pPhaP619C1437-PCT540 enzyme for enhanced production of PLA homopolymer. In fed-batch culture, the lactate fraction in the polymer was increased from 8.29 to 11.57 mol% and PHA content was increased from 10.52 to 18.81 wt% in the presence of the Phasin. Secondly, in order to produce PLGA, JLXF9 strain was constructed from JLXF7 by deleting the GlcDEFG genes. Poly(lactic acid-co-glycolic acid) [PLGA], the random copolymer of lactic acid (LA) and glycolic acid (GA), are biodegradable and biocompatible thermoplastic biopolymers with a broad range of industrial and biomedical applications such as drug delivery carriers. PLGA have received considerable interest because this is used in a host of Food and Drug Administration (FDA)-approved biopolymer. When JLXF9 strain harboring pTac15k-YcdW and pPs619C1437-CpPCT540 was cultivated by fed-batch fermentation, it was produced P(LA-co-GA) copolymers with 33 mol% of GA mol fraction and 41.56 wt% of PHA content. The PLGA copolymer of 24,000 Da was successfully produced from the final JLXF9 strain. In terms of industrial applications, the strain was further engineered to be capable of producing PLA from a cheaper carbon source than glucose, sucrose. Sucrose utilization pathway was constructed by introducing the Mannheimia succiniciproducens SacC gene encoding β-fructofuranosidase. The recombinant E. coli MKWL6 strain was able to produce PLA homopolymer with polymer content of 4.6wt% in the medium containing 20g/L glucose, and P(46.95mol% LA-co-53.05mol% 3HB) with polymer content of 41.84wt% in the medium supplemented with 20g/L glucose and 2g/L 3hydroxybutyreate (3HB). When overexpressing the M. succiniciproducens SacC gene and harboring $PhaC1437_{Ps6-19}$, $Pct540_{Cp}$, the recombinant E. coli MKWL6 strains could produce PLA homopolymer with polymer content 16.94 wt%, and that increased 2.86-fold compared with wild type W3110. These studies demonstrate that microorganisms can be engineered to produce industrially interesting polymers.
지구 온난화 등의 환경문제가 심각해짐에 따라 각종 환경 규제로 인한 원유가격의 상승 및 환경비용의 증가로 인해서 바이오기반의 화학물질의 수요가 계속적으로 증가하고 있으며, 화석연료의 소모를 줄이고 이산화탄소의 방출을 감소시키기 위한 노력으로 환경 친화적인 바이오매스 기반의 생물고분자로 기존의 석유유래 고분자를 대체하고자 하는 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 대사공학적으로 유전자를 변형시켜 미생물에서 바이오기반의 고분자 중에서 PLA와 PLGA를 생성하는 두 개의 독립적인 연구를 진행하였다. 폴리유산 (Polylactic acid, PLA)은 많은 재생 가능한 자원 유래 고분자들 중에서도 생분해성, 생체적합성, 구조적 안정성, 그리고 낮은 독성과 같은 뛰어난 물성으로 인해 석유 유래 플라스틱의 대체물로서 대두되고 있다. 그러나, 이러한 폴리유산은 미생물 발효를 통해 유산 (락트산, Lactic acid)을 생산하고 이를 정제한 후, 여러 가지 시약, 용매 및 촉매가 첨가되는 복잡한 공정의 화학적 중합반응에 의한 2단계의 복잡한 공정으로 합성되어진다. 그리고 이러한 과정에서, 유산의 용매중합반응 시에 생성되는 물과 불순물의 영향으로 인해 최종적으로 생산되어진 폴리유산은 분자량이 낮고 색상 또한 나쁘다는 단점을 지니고 있다. 그러나, 미생물의 직접발효를 통해 얻어진 폴리유산의 경우 중금속 촉매의 사용이 없기 때문에 의료분야와 식품포장에 사용할 수 있으며 높은 분자량의 폴리유산의 생산이 가능하다는 장점을 갖는다. Phasin(PhaP) 은 polyhydroxyalkanoate (PHA)의 granules에 관련된 단백질로 PHA 생합성과 PHA granules의 수와 크기에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있다. Phasin은 각 폴리머의 단량체 조성을 조절하고 분자량을 증가시키거나 graunule의 표면에 단백질 층을 형성하여 granules을 안정화시킨다. 이에 따라 미생물 유래 고분자인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 생합성 시스템을 도입하여 폴리유산과 그의 공중합체들의 생합성이 가능할 수 있는 대사경로를 구축하여 기존의 복잡한 2단계 공정을 통해 생산되던 폴리유산을 재생 가능한 바이오 연료로부터 미생물의 직접발효를 통해 생산할 수 있게 한 기존에 해왔던 연구를 바탕으로 PHA granules 을 안정화시키는 데 도움을 주는 것으로 알려져 있는 Phasin (PhaP) 란 단백질을 이용하여 좀 더 폴리유산의 mol fraction을 증가시키고 PHA content 및 분자량을 증가시키고자 실험을 진행하였다. PLA strain JLXF5에서 실험을 진행한 결과 Phasin이 발현된 쪽에서 8.57mol%에서 11.57mol% 로 lactate 몰 분율이 더 높아졌고, 10.52에서 18.81wt%로 PHA content도 증가함을 볼 수 있었고, 분자량도 더 높아진 것을 실험을 통해서 확인할 수 있었다.
생분해성 고분자로 알려진 Lactic acid와 Glycolic acid의 copolymer 된 형태인 PLGA는 분해성 고분자들 중에서 미국 식품의약청(FDA)의 승인을 받은 생체 친화적인 물질로, 가지고 있는 약물의 방출특성 때문에 약물전달체로서 사용되고 인공혈액, 조직공학용 지지체, 수술용 봉합사, 의학적인 분야에 다양하게 적용되고 있는 대표적인 물질이다. 또한 공중합체 내 LA와 GA의 비에 의해 서로 다른 분해속도를 나타내는 특징이 있는데 특히 LA : GA의 비율이 50 : 50 일 때가 가장 분해속도가 빨라서 2달 정도 후에는 완전히 분해되어진다.
따라서, 이러한 의약적으로 많이 활용되어지고 있는 PLGA를 대사공학적으로 생성하기 위해서, PHA 합성효소를 코딩하는 유전자 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자를 삽입하고, galyoxlate shunt에 관여하는 malate synthase를 코딩하는 유전자 (aceB)와 GlcDEFG 유전자를 삭제하고, isocitrate lyase (aceA)의 유전자의 프로모터를 trc 프로모터로 교체하여 증폭시킨 형질전환 된 변이체를 글루코스 함유 배지에서 배양하여 PLGA 공중합체를 생산하고자 실험을 진행하였다. 배양한 결과 최종 균주 41.26wt%의 PHA content와 24,000Da의 분자량을 가진 PLGA 폴리머가 생성되었다.
Sucrose는 주로 사탕수수나 사탕무로부터 생산되며, 한해 1억 6천만톤 가량 생산되고 소비되고 포도당보다 값이 탄 탄소원이다. 산업적 측면에서 이런 값이 싼 탄소 소스로부터 생분해성 고분자인 폴리유산을 생성하기 위해 Mannheimia succiniciproducens SacC 유전자를 도입하여 건설되었다. 재조합 대장균 MKWL6 균주에 이 SacC 유전자를 이용하여 sucrose로부터 6.94wt%의 고분자 함량을 가진 폴리유산을 생성하였다. 또한 포도당을 이용해서도 4.6wt%의 고분자 함량을 가진 폴리유산과 46.95mol%의 젖산과 53.05mol%의 3-하이드록시뷰티레이트를 가진 41.84wt%의 고분자 함량을 가진 중합체(copolymer)를 생성하였다. 이 연구는 대장균에서 대사공학적 기법을 통해서 산업적으로 흥미로운 다양한 고분자 합성 및 생산 방법을 제시하였고, 재생가능한 자원으로부터 산업적, 의학적으로 다양하게 쓰이는 비자연 고분자들을 대사공학 시스템을 통해서 생산할 수 있는 가능성을 제시할 것으로 생각된다.
