Fumaric and L-malic acid are the naturally occurring organic acids which were key intermediates of the tricar-boxylic acid cycle. In this study, Escherichia coli was metabolically engineered for the production of fumaric and L-malic acid. For the aerobic production of fumaric acid, the iclR gene was deleted to redirect the carbon flux through the glyoxylate shunt. In addition, the fumA, fumB and fumC genes were also deleted to enhance fumaric acid formation. The resulting strain was able to produce 1.45 g/L of fumaric acid from 15 g/L of glucose in flask culture. Based on in-silico flux response analysis, this base strain was further engineered by plasmid-born (pTac15k) overexpression of the native ppc gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase (PPC) under the strong tac promoter, which resulted in the production of 4.09 g/L of fumaric acid. Additionally, the arcA and ptsG genes were deleted to reinforce the oxidative TCA cycle flux, and the aspA gene was deleted to block the conver-sion of fumaric acid into L-aspartic acid. Since it is desirable to avoid the use of inducer, the lacI gene was also deleted. To increase glucose uptake rate and fumaric acid productivity, the native promoter of galP gene was replaced with the strong trc promoter. The final strain (CWF812) was able to produce 28.2 g/L fumaric acid in 63h by fed-batch fermentation with the overall yield and productivity of 0.389 g/goglucose and 0.448 g/L/h.
Similar approach was employed to produce L-malic acid using the iclR gene deleted strain under aerobic condi-tion. Then, we further deleted two known malate dehydrogenases (mdh and mqo) to accumulate L-malic acid under aerobic condition. However, there was no accumulation of L-malic acid in this strain. Thus, we further de-leted malic enzymes (maeB and sfcA) which could convert L-malic acid into pyruvate by gluconeogenetic activi-ties. As a result, we could obtain 0.53 g/L of L-malic acid in this strain. By over-expression of the ppc gene, we could significantly improve the L-malic acid titer up-to 3.13 g/L from 15 g/L of glucose in a flask culture. This study demonstrates the possibility for the industrial production of fumaric and L-malic acid in E. coli.
국제사회에서의 환경 오염문제 및 석유화학 에너지 고갈문제의 대두와 함께 기존의 석유화학 에너지를 대체할 수 있는 환경 친화적이고, 지속 가능한 에너지 개발을 위한 노력이 진행되고 있다. 이러한 문제를 해결할 수 있을 것으로 가장 큰 기대를 가지고 있는 대체 방법은 미생물을 통한 화학물질의 생산이다. 전통적으로는 자연적으로 유용한 화학물질을 생산하는 균주에 대한 발효공정 개발에 대한 연구가 많이 진행 되었으며, 20세기 후반부터는 재조합 DNA 기술의 개발과 함께 균주의 대사흐름을 우리가 원하는 방향으로 조작하여, 우리가 원하는 고부가 가치 화학물질 들을 생산해 낼 수 있는 대사공학적 균주 개발 연구가 많이 진행되어 왔다.
본 연구에서는 대장균이라는 산업적으로 널리 사용되며, 안전한 미생물을 대사공학적 균주조작을 통하여 유용한 C4 다이카르복실산 (Dicarboxylic acid) 인 푸마르산 (Fumaric acid) 과 L-말산 (Malic acid) 을 생산하고자 하였다. 현재의 이 화학물질들은 석유화학기반의 화학공정을 통하여 산업적인 생산이 이루어지고 있으나, 그 지속성에는 한계가 분명이 존재하므로 미생물 기반의 생산시스템을 구축 하고자 본 연구를 진행하였다. 푸마르산과 L-말산은 자연상에 존재하는 유기산이며, TCA 회로상의 중간물질들로 잘 알려져 있다. 미국 에너지성 (DOE) 의 보고에 의하면 이 두 물질은 미래 화학산업에서 바이오매스 (Biomass) 로부터 얻어질 수 있는 TOP 12 의 고부가 가치 화학물질로 선정될 만큼 그 잠재가치가 크다고 할 수 있다. 그 응용범위를 보면, 다양한 수지 (Resin), 가소제 (Plasticizer), 식음료 첨가제, 그리고 다양한 화학물질의 전구체 등 그 활용가치가 매우 크다.
푸마르산과 말산은 조작을 하지 않은 대장균 대사회로 상에서는 전혀 생산이 되지 않는 화학물질이므로, 대사공학적 균주 조작이 필연적이라고 할 수 있다. 푸마르산을 대장균에서 생산하기 위한 균주 조작 전략에 대해 살펴보면, 혐기적인 조건 하에서 푸마르산은 최종 전자 수용체로 작용함으로써 세포생장과 밀접히 연관되어 있으므로, 푸마르산에서 숙신산으로 전환시키는 효소인 fumarate reductase (frdABCD) 의 결실을 통한 생산전략에는 풀어야 할 연결고리에 대한 문제가 많이 존재하였으므로, 본 연구에서는 푸마르산을 호기적인 조건 하에서 생산하고자 하였으며, 이를 기반으로 균주의 대사회로를 새롭게 디자인 하였다. TCA 회로의 원활한 작동을 유지하면서 푸마르산을 생산하기 위하여, 먼저 glyoxylate shunt 의 대사흐름 강화를 위하여 local regulator인 iclR 유전자를 결실시키고, 이어서 세개의 알려진 fumarase (fumB, fumAC) 를 결실시킴으로써, 푸마르산을 생산해 낼 수 있는 기본 대사회로를 디자인 하였다. 이어서 푸마르산의 생산량을 증가시키기 위하여, in-silico simulation을 통해 예측된PPC 효소의 발현을 증가시킴으로써 큰 효과를 얻을 수 있었다. 또한 산화적 TCA 회로의 강화를 위하여 global regulator인 arcA 유전자의 결실을 통해 생산량을 증가시킬 수 있었으며, 추가적으로 PPC효소의 전구체인 PEP 양을 늘리기 위하여 ptsG 유전자의 결실을 통해 생산량을 더욱 늘릴 수 있었다. 다음으로 푸마르산에서 아스파르트산 (aspartic aid) 으로 전환시키는 효소인 aspA 유전자의 결실을 통하여 생산량 및 수율을 증가 시킬수 있었다. 또한 산업적인 생산에 있어서 IPTG를 이용한 유도발현 시스템에는 비용이나 안전성 등에서 문제가 있으므로, 항시발현 시스템을 구축하기 위하여 lacI 유전자를 결실 시켰다. 마지막으로 글루코오스 소모속도의 증가를 통해 푸마르산 생산성을 증가시키기 위한 목적으로 galP 유전자의 promoter 를 강력한 trc promoter로 치환 함으로써 생산성을 증가 시킬 수 있었다. 이처럼 합리적인 대사공학적 균주조작과 in-silico 예측 기법을 통하여 최초로 푸마르산을 생산하는 대장균을 개발하는데 성공하였다.
L-말산 생산균주의 개발은 푸마르산 생산과 유사한 접근방식으로 이루어졌다. L-말산의 경우는 기존에 미생물에서 대사공학적 균주 조작을 통해 생산한 보고가 많이 있었으므로, 본 연구에서는 새로운 접근방식의 균주조작을 통해 L-말산을 대장균 숙주에서 생산할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 균주의 개발은 푸마르산 균주와 마찬가지로 iclR 유전자를 결실시킨 균주에 추가적으로 알려진 두개의 malate dehydrogenase 인 mdh 와 mqo 를 결실시켰고, 이어서 알려진 두개의 malic enzyme인 maeB 와 sfcA 를 결실시켜 L-말산을 생산하는데 성공하였다. 이어서 PPC 효소의 과발현으로 L-말산 생산량을 크게 증대시킬 수 있었다.
본 연구에서는 새로운 대사공학적 접근방법을 통해 대장균에서 푸마르산과 L-말산을 생산함으로써 그 산업적 생산의 가능성을 제시하였다. 하지만 현재 우리가 미생물의 대사흐름에 대해 알고 있는 정보의 양의 한계로 인하여, 원하는 수준의 이상적인 균주개발에는 한계가 존재했다. 향후 연구에서는, 보다 최첨단의 연구기술을 접목시키고, 세포의 대사흐름을 시스템 수준에서 관찰 비교함으로써 효율적이고 강력한 균주 개발이 필요할 것으로 생각된다.
