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Synthetic biology approach for designing of photosynthetic escherichia coli = 광합성 대장균 제작을 위한 합성생물학적 연구
서명 / 저자 Synthetic biology approach for designing of photosynthetic escherichia coli = 광합성 대장균 제작을 위한 합성생물학적 연구 / Jin Eyun Kim.
저자명 Kim, Jin Eyun ; 김진년
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2013].
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초록정보

Increasing carbon dioxide concentration is a very serious problem. To solve this problem, various approaches have been done. Between of these approaches, photosynthesis is the most important approach because this is a key step for the carbon cycle of the Earth. An increased amount of carbon dioxide production must be fixed by photosynthetic carbon fixation for carbon circulation. In this study, converting a chemoheterotroph organism to a photoautotroph was studied using synthetic biology approach. First, introducing a photosystem in Escherichia coli was done to generate energy. For this result, light converted to chemical energy, which formed ATP. The energy conversion amount was 8.28 mmol ATP/gDCW·h. This result was done by introducing the proteorhodopsin, which absorbs specific wavelength. In this study, confirming co-expression of the different proteorhodopsin was done. At this result, The co-expressed proteorhodopsin absorbs wider wavelength of light, so the light usage efficiency can improve. Next, the dark reaction was studied. To circulate carbon fixation, Calvin cycle was introduced. Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus elongatus PCC.7942 Calvin cycle and Synechocystis sp. PCC 6803 carboxysome was introduced in Escherichia coli. The carboxysome functions to concentrate carbon dioxide and block oxygen, so Rubisco can fix carbon dioxide more efficiently. The forming $\beta$-carboxysome was shown in situ and in vitro images. The Rubisco activity was shown in vitro and in vivo. In this result, confirmed the Calvin cycle activity in Escherichia coli. Inside of the carboxysome, there are many enzymes, such as Rubisco and carbonic anhydrase. For encapsulation, selective specific enzymes replace with Rubisco was done in this study. The carboxysome without Rubisco gene was expressed and the empty carboxysome was confirmed with TEM image. The fumarase was encapsulated in the carboxysome to confirm the encapsulation. The fumarase encapsulated carboxysome was purified and an activity assay was done. As expected the result showed fumarase was indeed encapsulated in carboxysome. Through this system, we can express enzyme encapsulate in the carboxysome and this system expect to generate make anaerobic enzymes expression actively in an aerobic cell growth condition.

현재 인류는 지구 온난화라는 풀어야 할 숙제를 안고 있다. 지구 온난화의 가장 주요한 원인은 바로 이산화탄소 배출량의 증가에 의한 이산화탄소 농도의 증가이다. 이산화탄소의 농도를 줄이기 위해서는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째, 이산화탄소 배출량을 감소시키는 것이다. 이는 현재 많은 선진국들이 노력을 하고 있지만 그 노력에 비해서 성과는 턱없이 부족한 편이다. 두 번째 방법은 이산화탄소 고정화를 활성화 시키는 것이다. 이 이산화탄소는 지구의 탄소 대 순환계에서 식물들에 의해서 고정화가 된다. 이를 증가시키기 위해서는 숲의 면적을 증가시키는 방법 등 많은 방법이 있지만, 본 연구에서는 이를 위하여 화학합성 유기 영양 생물을 광합성 독립 영양 생물로 전환을 시키는 연구를 진행 하였다. 광합성 대장균을 제작하기 위해서 대장균에 광반응과 암반응의 도입을 진행하였다. 우선 광반응은 지구상에 세 가지가 있는데 그중 가장 간단한 광반응인 proteorhodopsin을 도입하였다. 여기서 proteorhodopsin을 특정 파장의 빛을 흡수하기 때문에 대장균에서 발현을 시켰을 때 대장균의 색깔이 변하는 것을 확인할 수 있었다. proteorhodopsin이 흡수하는 빛의 보색을 띄는 것을 확인함으로써 대장균에서 발현이 잘 되었음을 확인 할 수가 있었다. 이를 확인한 후, proteorhodopsin이 빛을 화학적 에너지로 전환시키는 양을 측정하기 위한 실험을 진행하였다. 그 결과, 8.28 mmol ATP/gDCW·h 만큼이 생산되는 것을 확인할 수가 있었다. 다음으로 암반응을 대장균에 도입하는 실험을 진행 하였다. 암반응은 남조류에 있는 Calvin cycle을 도입하였다. Calvin cycle을 구성하는 step은 총 11개로, 그중 9개의 step은 대장균에 존재하였다. 즉, Calvin cycle을 도입하기 위해선 2 step Rubisco와 phosphoribulokinase가 필요 하였다. 이를 효율적으로 도입하기 위해서 Carboxysome 또한 함께 도입하였다. Carboxysome이 도입 된 것은 in situ와 in vitro 두 가지로 확인을 진행 하였으며, Carboxysome 안에 존재하는 Rubisco의 활성이 in vitro에서 측정 되었다. Calvin cycle의 도입을 in vivo에서 확인하기 위해서 13C label pattern 분석을 진행 하였다. 그 결과 모 균주 대비해서 확실히 이산화탄소 고정화가 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 이는 대장균 안에서 Calvin cycle이 기능을 하여서 이산화탄소 고정 양이 증가한 것 이라고 할 수 있다. 또한 본 연구에서는, 위에서 도입을 진행한 Carboxysome을 이용하여 효소 고정화 기술을 제안 하였다. Carboxysome은 자가 조립에 의해서 제작이 되는데, 이러한 점을 이용 하여서 원하는 선택적인 효소를 Carboxysome 안에 고정 시키는 연구를 진행하였다. 이를 확인하기 위해서 fumarase가 이용이 되었으며, 실험을 진행한 결과 Carboxysome 안에 fumarase가 고정화 된 것을 확인 할 수가 있었다. 이번 연구에서는 광합성을 하는 대장균을 완성시키지는 못 하였지만, 그를 위한 발판이 되는 실험 결과들을 보여주었으며, 다음으로 가야할 길을 제시해주는 데 의의가 있다고 볼 수 있다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MCBE 13030
형태사항 v, 52 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김진년
지도교수의 영문표기 : Sang Yup Lee
지도교수의 한글표기 : 이상엽
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 44-50
주제 Rubisco
carboxysome
calvin cycle
proteorhodopsin
encapsulation
Calvin cycle
carboxysome
proteorhodopsin
대장균
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