Graphene oxide is one of the carbon nanomaterials which has been received much attention due to its unique physical and chemical properties and high potential in many research areas including application s as biosensors and drug delivery vehicles, recently. Various GO-based biosensors largely based on its surface adsorption properties, have been developed not only for the detection of biomolecules including oligonucleotides, peptides and essential proteins, but also for the monitoring of enzymatic reactions. Especieally we focused on the essential motro protein, helicase which unwind the double stranded nucleic acids into single stranded ones using energy from nucleoside triphosphate hydrolysis. They have been implicated in core cellular processes that require single stranded nucleic acids, including DNA replication, repair and transcription. Their position in vital process and highly conserved structures give advantages to use in disease treating target for drug discovery. Previously reported numerous helicase activity assay by direct observation and through the radio- and fluorescence- labeled approaches were contributed to unveiling helicase unwinding reaction and inhibitor screening, but they exhibited only poor activities in cell-based analysis. To overcome the current limitation of helicase activity assay platforms, we adopted the graphene oxide as trapping and sensing materials with fluorescenctly labeled substrates. Our newly reported graphene oxide based platform for the assay of duplex-DNA unwinding activity against SARS CoV helicase repre-sented several advantages over the conventional methods, including real-time monitoring, cost-effectiveness, easiness in preparation and assay, and high-throughput screening feasibility.
Next, we improved the system to multiplexed helicase assay for high-throughput screening of inhibitors of incurable disease target protein HCV NS3 helicase and SARS CoV helicase. The measuring of HCV and SARS CoV helicase activity was easily accomplished in a single mixed solution using two distinct DNA substrates tethered to different fluorophores. One round of library screening to discover highly selective small-molecules consisted antiviral direct acting drug candidates. In conclusion, a multiplexed screen by using graphene oxide based helicase activity assay platform is highly advfantageous not only because multiple rounds of screening are combinded into one screen to reduce the overall cost and labor, but also because just one round of multiplexed screening provides information on the relative selectivity of the hit compounds towards each target disease helicase. This multiplexed platform can be used to evaluate helicase activities in a highly parallel manner and of helicase-inhibitor-based antiviral drugs for various diseases.
산화그래핀은 탄소 동소체 중 하나로 그 독특한 물리화학적 특성과 바이오센서, 약물전달 등의 넓은 분야에 대한 높은 응용 가능성 때문에 최근 많은 관심을 받아오고 있다. 다양한 표면 흡착 특성 기반 산화그래핀 이용 바이오센서가 개발되고 있으며, 올리고핵산, 펩티드, 그리고 필수 단백질들의 검출뿐만 아니라, 효소 활성 확인에도 이용되고 있다. 특히 우리는 핵심적인 모터 단백질인, 이중가닥 올리고핵산을 단일가닥으로 뉴클레오티드 삼인산의 가수분해에 의한 에너지를 통해 풀어주는 역할을 하는 헬리카제에 주목하였다. 헬리카제는 단일 가닥 올리고핵산이 필요한 디옥시리보핵산 복제, 수리 그리고 전사등의 중심 세포사 단계에 관여하고 있다. 이러한 그 역할과 높게 보존된 구조로 인해서 약물 치료 타겟으로 큰 장점이 있다. 이전에 보고된 많은 헬리카제 활성 분석법들은, 방사성 혹은 형광표ㅗ지를 통한 직접 관찰법으로, 이를 통해 헬리카제의 풀림작용된 저해제 도출에 큰 기여를 하였지만, 세포 단계에서의 약효확인 등에서 좋지 않은 결과를 보여왔다. 이러한 기존의 헬리카제 활성 분석법의 한계를 극복하기 위하여 우리는 산화그래핀을 흡착제 겸 형광 소광제로 사용하였다. 우리의 새로운 급성호흡기 증후군 헬리카제를 대상으로한 이중가닥올리고핵산의 풀림 활성을 관찰하는 산화그래핀 분석법은 기존 분석법에 비해 실시간 관찰, 가격의 저렴성, 준비와 실험에서의 간편성, 고효율 스크리닝 가능성 등의 장점을 보였다.
다음으로 우리는 다중 헬리카제 기능의 C형 간염과 급성호흡기증후군 헬리카제 저해제의 고효율 스크리닝이 가능한 분석법으로 발전시켰다. C형 간염과 급성호흡기증후군 헬리카제의 활성은 각각의 형광표지된 DNA 기질을 하나의 용액에 혼합시킴으로 간단히 달성할 수 있었다. 한 세트의 라이브러리 스크리닝을 ㅌ오해 항바이러스성 약물 후보군을 도출하여 줄 수 있었다. 결론적으로 산화그래핀 기반 헬리카제 활성 분석법을 통한 다중 스크리닝 분석법은 많은 횟수의 스크리닝을 합쳐 한번에 진행해서 가격과 노동면에서 절감할 수 있다는 장점 뿐만 아니라, 한 번의 복합 스크리닝이 도출된 약물의 목표 질병 헬리카제에 대한 상대적인 선택성 등의 정보도 확인할 수 있다는 장점이 있다. 이 복합 분석법은 헬리카제 저해제 기반의 항바이러스성 약물 도출에 큰 도움이 될 수 있다.
