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Oligonucleotide drug delivery, cellular response, and RNA sensing by biofunctional nanomaterials = 생기능성 나노물질에 의한 올리고핵산 약물전달, 세포 반응, RNA 감지에 관한 연구
서명 / 저자 Oligonucleotide drug delivery, cellular response, and RNA sensing by biofunctional nanomaterials = 생기능성 나노물질에 의한 올리고핵산 약물전달, 세포 반응, RNA 감지에 관한 연구 / Soo-Ryoon Ryoo.
저자명 Ryoo,Soo-Ryoon ; 유수윤
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2012].
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Gene therapy may be therapeutically useful in relieving symptoms and treating any kind of diseases which hybridize with their complementary target site in mRNA, blocking translation to protein expression of patho-physiologic genes. These strategies include DNAzymes, siRNA, antisense oligonucleotides (ASO), ribozymes, and aptamers. Among these molecules, deoxyribozymes (DNAzyme, Dz) have been paid attention as therapeutics both in cell-based assays and in preclinical models of diseases including cancer and viral infectious diseases. The “10-23” RNA cleaving DNAzyme has been shown to cleave any purine-pyrimidine junction under simulated physiological conditions, therefore efficiently inhibiting expression of target proteins in vitro and in vivo studies. These molecules ideally combine the catalytic activity of ribozymes with the stability of oligodeoxynucleotides, are easy to synthesize and less sensitive to chemical and enzymatic degradation than RNA-based reagents. Factors to influence the eventual therapeutic use of DNAzymes include its efficient cellular uptake, subcellular localization, and stability. A particularly important challenge to achieve the successful down-regulation of gene expression is to deliver DNAzymes efficiently to its intended site of action. Since various nanomaterials have unique, useful chemical, physical, and mechanical properties, they can be used for a wide variety of applications including nano-based biosensors, drug delivery devices, diagnostic tools, and means for tissue engineering and fundamental cell biology studies, etc. In chapter 2, we describe synthesis and characterization of a multifunctional magnetic nanoparticle (MION) for both noninvasive in vivo imaging and delivery of DNAzyme to target organ for hepatitis C treatment. Hepatitis C is one of the infectious diseases in the liver caused by the hepatitis C virus (HCV), a small-sized, enveloped, positive sense single strand RNA virus. The multifunctional nanoparticles consist of magnetic nanoparticles labeled with near-infrared fluorescent dye and conjugated to a synthetic DNAzyme targeting a gene of interest. In addition, these nanoparticles are tailored with cell-penetrating peptides (CPPs) helping membrane translocation process. We demonstrated the silencing effect of a gene of interest by Dz-loaded multifunctional nanoparticles in cultured human liver cells (Huh-7). For in vivo study in mice, we performed the alkaline phosphatase activity assay using sera to measure the efficiency of DNA transfection, and found that the hydrodynamic delivery of the reporter plasmid elicited and was maintained over-expression in mice for some periods. The delivery of the nanoparticles would be monitored in dual fashions in vitro and in vivo. We believe that our Dz-conjugated nanoparticles will be one of the widely applicable therapeutic options for the efficient HCV treatment in near future. Carbon based nanomaterials have shown much interest due to their unique structural and electrical properties such as mechanical strength, flexibility, electrical transport capability, young’s modulus, lightness and chemical inertness. Especially, graphene has the infinite possibilities to serve as novel nanoscale building blocks to create distinctive macroscopic materials. Due to their outstanding thermal and mechanical properties and high electrical conductivity, graphene sheets have been considered as a promising candidate for nanoelectronic devices, quantum computer, transparent electrode, and nanocomposite materials. Conductive substrate show great potential in biological applications such as tissue engineering, implants, drug delivery carriers, biochips for diagnostics and nano-devices for biological study. Substrates for immobilizing cells and tissues are valuable in use of biological and medical field study. The adhesion and spreading of mammalian cells is mediated by the binding of cell-surface integrin receptors to peptide ligands from the extracellular matrix (ECM) and the clustering of these receptors into focal adhesion complexes. Integrins play a critical role in the formation of focal adhesions, which attach cells to the extracellular matrix. It has been reported that the interaction between cells and ECM depends on the multiple substrate characters such as chemical composition, geometry, and topological aspects, ligand organization, and substrate stiffness. In addition, these factors of engineered substrates based on nanomaterials can affect and even lead to various cellular responses and cell physiology. Little is to investigate their properties that make the influence of carbon based nanomaterials including graphene sheet on living system. While the advancements in technology may be considerable, there is also concern about unintended effects of exposure to nanomaterials. In chapter 3, the chemically modified graphene oxides were immobilized on the glass substrates and used as a substrate for mammalian cells as a model of biological system to examine their influence on cell adhesion, spreading pattern and proliferation by various assays. We believe our result could serve as a fundamental standard for biological investigation of chemically prepared graphene-based nanomaterials. As biomolecules inside cells including proteins, nucleic acids, and small molecules show a variety of expression level and pattern, localization or distribution, they are considered as the critical parameters that reflect the state of organism including cellular behaviors, function, proliferation, development, physiological and pathological states. In that point of view, the build-up of the biomolecule detection method is one of the important issues in the biomedical field for the treatment process of all sorts of diseases. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small-sizes (10~25nt) and non-coding RNA molecules that play an important regulatory role in the expression of diverse genes. Interestingly, miRNAs as the attractive biomolecule have been paid great attentions in a wide range of biological processes like development and metabolism and pathological progresses of disease/ disorders. Here, we fabricated the microRNA analytical platform for rapid, simple, and sensitive detection using nano-sized graphene oxide and detection probe PNA (peptide nucleic acid) for this study. In chater 4, we evaluated that 1) the probe-nanographene complex can work as microRNA sensing platform with efficient fluorescence quenching and recovery ability, 2) nanographene oxide sheets can serve as a delivery carrier of detection probe into live cells for real-time monitoring and quantitative analysis of microRNA and 3) the nanogrpahene oxide sheets provide the stable loading platform in the complex biological solutions and samples.

나노물질은 물질 자체가 가지고 있는 독특한 물리, 화학적 성질과 광학적 특성들에 대한 연구가 진행되면서 산업분야 외에도 바이오의학 분야로의 응용으로의 활발한 연구가 진행되고 있다. 본 논문의 chapter 2에서는 이러한 나노물질이 의학 분야에 이용됨에 있어 약물전달체로의 개발과 응용에 초점을 두고 있다. 본 연구에서는 자성을 띄는 나노입자를 C형 간염 치료를 위한 올리고핵산 약물 전달에 이용하였다. 본 연구에서 사용한 나노입자의 경우, 미국 FDA의 승인을 받았을 뿐 아니라 이미 임상에서 MRI 조영제로 사용되고 있어 이미 그 안전성과 생체 적합성이 인정을 받았다. 이러한 입자를 이용해서 유전자 치료를 위한 올리고핵산 약물 전달의 장애물들을 극복할 수 있었다. 올리고 핵산을 기반으로 하는 약물들은 세포 및 생체 내에 많이 존재하고 있는 핵산분해효소 등과 같은 외부 효소에 의한 분해, 전체적으로 음전하를 띄고 있기 때문에 발생하는 효과적인 세포막 투과의 어려움 그리고 약물 자체에 표적능 결핍 등의 단점이 있다. 본 연구에서는 C형 간염을 모델 질환으로 하였고, 항바이러스제 개발의 가장 좋은 타겟으로 알려진 HCV NS3 protease의 mRNA를 분해할 수 있는 안티센스 올리고핵산 제재 전달을 위해 산화철 나노입자를 사용하였다. 약물 탑제한 입자의 세포막 투과를 돕는 세포막 투과 펩타이드와 실시간 모니터링이 가능하도록 이미징 할 때 투과율이 우수한 근적외선 형광물질을 도입하여 다기능성 나노입자를 제조하였다. 이를 통해 올리고 핵산 약물이 효과적으로 세포 안으로 전달되어 작동할 뿐 아니라 마우스의 피하에 이종이식된 C형 간염의 모델 세포주 덩어리에서도 다기능성 나노입자가 작동함을 확인할 수 있었다. 이 외에도 나노입자를 치료의 목적에 맞게 표면을 개질하고 원하는 기능성을 부여할 수 있어 다각도로 치료 효과 극대화를 도모할 수 있어, 그 응용 가능성은 앞으로도 더욱 크다고 할 수 있다. 나노물질을 기반으로 한 바이오 응용이 더욱 발전하고 시너지 효과를 내기 위해서는 나노 물질들의 물리, 화학적 성질을 포함하는 다양한 특성에 대한 체계적인 이해와 이를 바탕으로 한 조작 기술들이 필요하다. 이를 이용한 나노물질의 성공적 활용은 최근 더욱 주목 받고 있는 나노물질을 기반으로 한 약물전달체 및 바이오 센서 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 보인다. 본 논문의 chapter 3과 4에서는 최근 생명공학 분야에 탄소나노튜브나 그래핀과 같은 탄소나노물질을 응용하려는 노력이 계속적으로 시도되고 있는 흐름에서 이러한 나노물질과 다양한 생분자 그리고 살아있는 세포 사이에서 일어날 수 있는 일련의 사건들에 대한 연구 및 응용을 진행하였다. 표면에 서로 다른 표면 작용기를 가진 두 가지 카본 나노물질인 그래핀과 다중벽 카본나노튜브를 기판에 부착한 한 후 여기에 마우스 섬유아세포를 배양하여 세포 생존, 부착, 퍼짐 등 세포 반응에 대한 연구를 진행하였다. 제작한 카본나노물질 기판은 서로 다른 소수성과 표면 거칠기를 보였으며, 안정적으로 기판에 부착되어 있음을 확인했다. 기판 위에서 세포를 배양한 후 세포의 증식율, 세포 모양 분석, 세포의 초점 부착 연구, 세포 초첨부착 과정 관련된 유전자 발현의 정량적 분석을 시도하였다. 세포 배양에 있어서 카본나노물질을 부착한 기판들에서 높은 생체적합성을 발견할 수 있었다. 세포 부착 과정에 있어서 세포는 세포 외 기질과 인테그린이라고 하는 세포막 수용체 단백질을 통해 다른 세포 골격 단백질들과 국소부착단백질 복합체를 이루며 연결 되어 있다. 본 연구에서 인테그린이 국소부착 형성시 말단의 탈린과 액틴 세포 뼈대를 연결하는 세포막-세포뼈대 단백질 빈쿨린의 세포 내 분포와 발현 양상이 카본나노물질을 부착한 기판에서 다르게 나타남을 관찰할 수 있었다. 일련의 체계적인 분석을 시도한 후 기판에서 바이오 분야로의 응용성을 알아보고자 기판 위에서 세포를 배양하고 여기에 유전자를 전달하여 그 효율을 알아보았다. 흥미롭게도 카본나노물질을 부착한 기판에서 30~50% 정도의 낮은 세포 밀도에도 불구하고 유전자 전달 효율이 250% 가까이 증가함을 관찰할 수 있었다. 카본나노물질을 부착하여 제작한 기판의 높은 생체적합성과 바이오응용 가능성을 확인하였고 이를 통해 세포의 기능을 향상시키면서도 기계적으로 강도가 우수한 또한 다양한 장점을 가진 카본 나노물질 부착 기판을 조직공학, 임플란트 디바이스의 개발에 응용할 수 있음을 확인하였다. 탄소나노물질들은 표면적이 넓고, 전기 전도성이 우수할 뿐 아니라 데옥시리보핵산과 같은 생체분자들이 공유결합 혹은 비공유결합으로 탄소나노물질에 흡착이 가능하다. 이러한 성질은 다양한 생체분자에 대한 검출 능력 및 민감도 증대에 기여하는 것이 보고 됨에 따라 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다. 탄소나노물질들 역시 다양한 화학적 반응을 통해 표면을 변형하고 원하는 기능기를 도입하는 것이 가능하여 수용성이 증대될 뿐 아니라 이러한 특성은 바이오 응용에 장점으로 활용될 수 있다. 본 논문에서는 생분자 물질을 감지하는 센서 플랫폼 개발을 위해 산화그래핀을 이용하였다. 타겟 생분자 물질은 마이크로 알엔에로 하였다. 마이크로 알엔에이는 생체 내 정상적인 생물학적 기능들에 관여할 뿐 아니라 질병 혹은 질환의 과정에도 관여하는 매우 중요한 생분자 물질입니다. 그러한 이유로 바이오마커로써 많은 주목을 받고 연구가 진행되고 있는 실정이다 많은 연구를 통해서 질병과 질환의 진단 외에도 질병의 치료 이후 예후판단의 지표로써 사용될 수 있기 때문에 마이크로 알엔에이를 감지하고 정량하며 발현을 관찰하는 것의 의의는 크다고 할 수 있으며 이러한 감지 기술을 개발하는 것은 매우 중요하다. 타겟 마이크로 알엔에이에 대하여 상보적인 염기서열을 지닌 프로브를 제작하고 여기에 유기형광염료를 도입한 이후 산화그래핀 표면에 흡착을 유도하고 여기에 합성된 타겟 마이크로 알엔에이를 도입하여 산화그래핀에 의해 소광되었던 유기형광염료의 형광시그널이 회복됨을 관찰할 수 있다. 기존의 마이크로 알엔에이 감지 및 정량의 연구와의 차별점은 본 연구에서는 살아있는 세포에서 실시간으로 마이크로 알엔에이의 존재와 발현 정도를 알 수 있다는 것이다. 이를 위해 흡착된 프로브가 세포 안으로 전달되어야 하므로 산화그래핀의 크기를 세포 도입이 가능하도록 조절하여 제작하였다. 또한 유기형광염료가 달린 프로브는 올리고핵산을 기반으로 하는 것이기 때문에 세포 내 다양한 환경의 핵산분해효소에 저항성을 가지도록 변형된 올리고핵산을 선택하였다. 이를 이용해 여러 세포주에서 하나의 타겟 마이크로 알엔에이를, 하나의 세포 중에서 여러 타겟의 마이크로 알엔에이를, 그리고 특정 자극에 의해 시간 대별로 유도되는 마이크로 알엔에이의 발현 변화를 감지 및 정량할 수 있었으며 기존에 사용하는 방법들과 비교하여 볼 때 높은 수준의 신뢰도를 보임을 확인하였다. 이러한 연구는 나노물질과 생물분자 혹은 세포가 함께 결합된 혼성 나노재료 및 시스템의 개발을 가지고 오며 이는 나노크기 수준의 생체 현상을 이해하고 규명하는 데 기여할 수 있을 뿐 아니라 비용이 저렴하면서도 민감도가 높은 혁신적인 디바이스를 만드는데 도움을 줄 수 있을 것으로 보인다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCH 12017
형태사항 xi, 122 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 유수윤
지도교수의 영문표기 : Young Hoon Lee
지도교수의 한글표기 : 이영훈
수록잡지명 : "Behaviors of NIH-3T3 fibroblasts on graphene/carbon nanotubes: proliferation, focal adhesion, and gene transfection studies". ACS Nano, v.4.no.11, pp.6587-6598(2010)
수록잡지명 : "Functional Delivery of DNAzyme with Iron Oxide Nanoparticles for Hepatitis C Virus Gene Knockdown". Biomaterials, v.33.no.9, pp.2754-2761(2012)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과,
서지주기 Including references
주제 Nanomaterials
oligonucleotides
cellular response
MicroRNA
나노물질
올리고핵산
세포 반응
마이크로 알엔에이
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