서지주요정보
Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of hydrocarbons substituting gasoline = 대장균을 이용한 가솔린 대체연료 생산에 관한 연구
서명 / 저자 Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of hydrocarbons substituting gasoline = 대장균을 이용한 가솔린 대체연료 생산에 관한 연구 / yong Jun Choi.
저자명 Choi, Yong Jun ; 최용준
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2012].
Online Access 원문보기 원문인쇄

소장정보

등록번호

8034077

소장위치/청구기호

학술문화관(문화관) 보존서고

DCBE 12029

SMS전송

도서상태

이용가능

대출가능

반납예정일

초록정보

Recent global issues associated with the rapid increase in the oil price and exhaustion of fossil fuels revealed the urgent necessity of alternative fuels and chemicals from renewable carbon sources. With this rising concerns, metabolic engineering has become a promising tools for the microbial production of bio-based fuels and chemicals due to its ability can modify metabolic network towards various bioproducts. The biogasoline and its substitutes, which is biopropanol, were produced by systems metabolic engineering. First, the medium chain length alkanes (MCLAs), hydrocarbon range from C5 to C14, can be used directly as transportation fuels, gasoline or jet fuel. Bio-based production of MCLAs can indeed solve the current crisis of limited fossil fuels and global environmental problems. However, production of MCLAs has not been reported. Here we report for the first time, the bio-based production of MCLAs by metabolic engineering of Escherichia coli. Final engineered strain was able to produce a mixture of hydrocarbon including nonane and (C9), tridecane (C13) and pentadecane (C15) up to 0.95 g/l from 100 g/l glucose. This result now opens a new way towards development of sustainable platform technologies for the production of transportation fuels using renewable biomass. Second, 1-propanol was produced from L-threonine-overproducing TH20 strain in which flux toward L-threonine was increased by removing feedback inhibition of aspartokinase I and III and threonine dehydratase, eliminating negative transcriptional regulation and suppressing L-threonine degradation. The L-threonine precursor pool in this strain was also increased by deleting genes for competing pathways and replacing the native promoter of the ppc gene, encoding phosphoenolpyruvate carboxylase, with the strong constitutive tac promoter. This engineered L-threonine-overproducing strain, TH20, has now been engineered for 1-propanol production from 2-ketobutyrate by rational metabolic engineering. We first eliminated feedback inhibition of L-isoleucine by replacing the ilvA gene encoding a mutated threonine dehydratase (designed to block L-threonine degradation in the TH20 strain) with another mutated ilvA gene containing changes in four nucleotides. We also replaced the native promoter of the ilvA gene with the tac promoter. The ilvI, ilvH, ilvB, and ilvN genes (encoding competing pathway enzymes) were deleted to make more precursors available for 1-propanol biosynthesis. Moreover, rpoS was deleted to relieve the RpoS-mediated general stress response and up-regulate L-threonine metabolism. Finally, using an in silico flux-response analysis, we demonstrated that fermentation from glycerol, which generates twice the amount of reducing equivalents compared to glucose fermentation, was advantageous for 1-propanol production. The final engineered strain, PRO2, harboring plasmids overexpressing atoDA, $adhE^{mut}$, thrA, thrB, thrC, ackA and cimA, produced 10.3 g $L^{-1}$ of 1-propanol from 40 g $L^{-1}$ of glycerol in aerobic fed-batch fermentation. This report describes the first successful production of 1 propanol under respiro-fermentative culture conditions through systems metabolic engineering. Moreover, the concentration obtained is the highest reported for bio-based production of 1-propanol.

최근 화석연료의 부족과 고갈의 위험성이 예기 되는 시점에서 고갈 되어 가고 있는 화석 연료를 대체 할 수 있는 대체 에너지 연구에 많은 관심이 집중되고 있다. 이중 최근 바이오 연료가 화석 연료의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도록 증가하고 있다. 바이오 연료는 화석 연료와 비교했을 때 지구 온난화의 주원인인 이산화탄소의 양을 증가시키지 않으며 매장량이 한정되어있는 화석연료와는 달리 재생 가능하다는 장점이 있다. 이런 바이오 연료에는 여러 가지 종류가 있으나, 그 중 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가 등, 현재 사용중인 화석 연료를 기반으로 한 연료와 가장 유사한, 예를 들어 가솔린의 대체 연료인 알칸 (alkane) 및 디젤의 대체연료인 바이오 디젤 (biodiesel), 그리고 현재 사용중인 가솔린과 혼용하여 사용 가능한 프로판올 (1-propanol) 을 생산하기 위한 대사공학적 설계에 집중하여 연구를 진행하였다. 특히, 알칸의 경우 탄소 길이가 14개 이상일 경우 이를 가솔린으로 사용하기 위해서는 cracking 과정을 거쳐야 하며, 디젤의 경우도 마찬가지로, 탄소 길이가 15개 이상인 화합물 보다 탄소 개수가 14개 보다 적은 화합물일 경우 연료로써, 활용도 및 가치가 높다고 한다. 최근, 미생물을 이용한 알칸 및 디젤 생산에 관하여 보고된 바 있지만, 탄소 개수가 14개 이하인 화합물을 생산한 사례는 아직 보고 되어 있지 않다. 따라서, 본 연구에서는 탄소 길이가 14개 이하인 알칸 및 바이오디젤 그리고 프로판올을 세계 최고의 농도로 생산하고자 하였다. 탄소 길이가 14개 이하인 중간 길이의 알칸 및 디젤을 생산하기 위해서는 탄소 길이가 14개 이하인 지방산을 생산할 수 있는 능력을 갖는 미생물을 플랫폼 구축이 필수적이다. 지방산 생산 대사는 에너지 집약적 과정으로, 예를 들어 탄소 개수가 16개 인 palmitate 한 분자를 만들어 내기 위해서는 세포 내 에너지 생산 및 바이오 매스 형성에 매우 중요하게 작용하는 acetyl-CoA를 8분자, ATP 7 분자, 그리고 NADPH 14분자를 필요로 한다. 이를 근거로, 첫째 많은 양의 acetyl-CoA를 확보 하기 위하여, acetyl-CoA가 acetate로 전환되는 대사 회로인 pta-ackA회로를 차단하였고, 생산된 지방산이 에너지원으로 사용됨을 방지하기 위하여, oxidation 회로를 차단하였다. 또한, NADPH를 확보 하기 위하여 NADPH 생산의 주요 대사회로인 pentose phosphate pathway를 증폭하여, 기존 모 균주 대비 약 40% 가량 증가된 NADPH pool을 확보 할 수 있었다. 대부분의 미생물은 lipid membrane의 구성성분인 탄소 체인이 긴 지방산을 주로 만든다고 알려져 있다. 탄소 체인이 14개 이하의 중간 길이의 바이오 연료를 생산 하기 위해서는 탄소 체인이 14개 이하의 지방산 생산이 필수 적이다. 지방산 합성에 있어서, malonyl-ACP는 지방산 합성의 시작 및 체인 합성에 모두 사용되는 중요한 중간 대사 물질로써, malonyl-ACP에 사용방향에 따라, 지방산의 탄소 체인 길이가 결정지어질 거라는 가설을 세우고, 이를 검증하기 위하여, malonyl-ACP를 기질로 사용하며, 지방산 합성을 개시 하는 효소인 fabH 를 가상 세포 모델을 통하여 조절해 보았다. 그 결과 가상 세포 모델에서 fabH 유전자의 발현량을 점진적으로 증가 시켜 본 결과, 탄소 길이가 긴 지방산의 경우 생산량이 감소하는 반면, 탄소 길이가 짧아질수록 감소하지 않고, 점진적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과가, 실제 세포에서도 얻을 수 있는지 확인 하고자, 세포내 fabH 유전자의 promoter를 강력한 trc로 치환하여 발현량을 증폭 시켜 본 결과, 가상 세포 모델의 결과와 일치하는, 85% 의 길이가 긴 탄소 체인을 갖는 지방산이 60% 까지 감소하였고, 11% 의 중간 길이의 탄소 체인을 갖는 지방산이 11% 에서 34% 까지 증가함을 확인 할 수 있었다. 이 균주를ALK7이라 명명하였고, 이 균주에, 지방산 생산에 필요한 유전자인 cytosolic tesA, fabD 그리고 fabG를 추가 도입하여 현존 최고 농도의 3.1 g/L의 지방산을 생산 할 수 있었다. 첫째로 이 ALK7 균주를 기반으로 한 알칸을 생산하기 위하여, 알칸 생산에 필수적인 효소인 decarbonylase 및 fatty acyl-CoA reductase를 추가로 도입하였다. Arabidopsis thaliana로부터 fatty aldehyde decarbonylase 및 Clostridium kluyberi 및 Clostridium acetobutylicum으로부터 fatty acyl-CoA reductase를 도입하였다. 지방산을 다량 생산 할 수 있는 ALK7 균주에 fatty aldehyde decarbonylase, fatty acyl-CoA reductase 및 fatty acyl-CoA synthase를 추가로 증폭 하여 발효 하여 glucose 60 g/L로부터 C13과 C15을 포함한 약 210 mg/L의 알칸 을 생산 할 수 있었다. 기존 균주에서 alkane을 생산 하기 위하여 fatty acid transporter를 증폭하였는데, 이에 대한 효과를 검증하기 위하여 transporter를 knockout 해본 결과 C13과 C15을 포함한 알칸이 97 mg/L로 감소하여 알칸 생산에 있어서, fatty acid transporter 또한 매우 중요한 요소임을 알 수 있었다. 이렇게, 지방산을 다량 생산 가능한 ALK7 균주에 알칸 생산에 필수적인 효소들을 도입함으로 해서 가솔린 범위에 속하는 C11및 C13와 C15등을 포함 하는 알칸을 1143.16 mg/L 까지 생산 할 수 있었다. 둘째로, 이 ALK7 균주를 기반으로 한 바이오 디젤을 생산하기 위하여 바이오 디젤 생산에 필수적인 wax synthase 및 alcohol dehydrogenase를 추가로 도입함으로 해서 중간 길이인 C12과 C14 그리고 C16까지 포함한 바이오 디젤을 470 mg/L 생산 할 수 있었다. 이 연구에서는 대장균의 지방산 합성 및 대사회로를 조작하여, 중간길이의 알칸 및 바이오 디젤을 합성하는 독창적인 시스템을 확립하였다. 이렇게 생산된 바이오 연료는 기존 생산 되었던 바이오 연료처럼 화학적 cracking 과정을 거치지 않고 곧 바로 연료로 사용할 수 있다는 점에 의의가 있다고 할 수 있겠다. 다음으로 현재 사용중인 가솔린과 혼용 가능한 프로판올을 생산하기 위하여, 쓰레오닌을 다량 생산 할 수 있는 TH20을 모균주로 하여, 쓰레오닌 대사체인 2-ketobutyrate로부터 프로판올 생산을 유도 하였다. 이를 위해서는 우선, 쓰레오닌을 대사체인 2-ketobutyrate로 전환 시키는 유전자를 증폭하였고, 쓰레오닌 및 2-ketobutyrate를 전구체로 사용하는 모든 대사회로를 차단하였다. 이럼으로써, 혐기조건에서 약 0.33 g/L의 프로판올을 생산 할 수 있었으나 생산된 프로판올에 비해 많은 양의 아세트산이 부산물로 생성되었다. 다량으로 생산된 아세트산을 감소시키기 위하여, acetyl-CoA를 프로판올 생산에 전환 시키는 방법과, 세포 배양조건을 혐기조건에서 호기조건으로 바꾸는 전략을 사용해 보았다. 그중 첫번째 전략을 검증 하기 위하여, Methanosarcina acetivorans의 citramalate synthase를 도입함으로 해서 약 40% 가량 증가된 0.436 g/L의 프로판올을 생산 할 수 있었고, 10% 가량의 acetic acid를 감소시킬 수 있었다. 두번째 전략을 검증하기 위하여, 혐기조건에서만 활성을 갖는 다고 알려져있는 alcohol dehydrogenase의 유전자 서열을 조작하여 호기 조건에서도 활성을 갖도록 변형 시켰다. 이렇게 유전자 서열이 조작된 alcohol dehydrogenase를 도입한 결과 약 20% 증가된 0.526 g/L의 프로판올을 생산 할 수 있었으며, 혐기조건에서 4.18 g/L의 acetic acid를 0.17 g/L까지 감소 시킬 수 있었다. 이에 추가로 propionate kinase 의 도입 및 stress responsible element인 rpoS의 knock out을 통하여, 1.38 g/L의 프로판올을 생산 할 수 있었다. 일반적으로 한 분자의 지방산 으로부터 한 분자의 알코올을 생산 하기 위해서는 NADH 두 분자가 사용된다. 따라서, 보다 많은 양의NADH 확보 및 값 싼 raw material인 glycerol을 사용하여 프로판올 생산에 있어 최고 농도인 10.3 g/L를 생산 할 수 있었다. 본 연구는 시스템 대사공학을 이용한 바이오 연료 생산에 대한 방법을 제시하며, 더 나아가 미생물을 이용한 바이오 연료 생산의 산업화에 기술 및 방향을 제시하는 데 큰 의의가 있다고 할 수 있겠다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCBE 12029
형태사항 154 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 최용준
지도교수의 영문표기 : Sang Yup Lee
지도교수의 한글표기 : 이상엽
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 133-142
주제 metabolic engineering
biofuel
gasoline
diesel
escherichia coli
대사공학
바이오연료
가솔린
디젤
대장균
QR CODE qr code