We herein describe a novel electrochemical real-time polymerase chain reaction (ERT-PCR) utilizing silver ion ($Ag^+$) aptamer-modified primer. In this work, we designed the primer to be extended by $Ag^+$ aptamer at the 5’ end, which would initially form a hairpin structure entrapping $Ag^+$. The $Ag^+$ in this bound state cannot actively participate in the redox reaction due to the low diffusivity, resulting in the low electrochemical signal. In the presence of target DNA, however, the $Ag^+$ is released from the aptamer as the opposite DNA strand is synthesized or as the $Ag^+$ aptamer-modified primer anneals to the extended template during the PCR process. Since the released free $Ag^+$ has much higher diffusivity than the bound one, the $Ag^+$-mediated electrochemical signal would increase in accordance with the number of PCR cycles. Based on this simple design principle, we successfully detected the Enterococcus faecium (E. faecium) genomic DNA (gDNA) down to $3.085 × 10^2 copies/\mul$ with excellent selectivity against non-target DNAs. This method has a great potential of serving as a key platform technology to advance an electrochemical genetic diagnostic system for a point-of-care testing (POCT) purpose.
본 연구에서는 신개념 전기화학적 실시간 중합효소반응(ERT-PCR)의 개발에 대한 내용으로, 은 이온($Ag^+$)에 대한 압타머를 프라이머 말단에 수식함으로써 신호 시스템을 구축하여 기존의 형광 기술 기반의 실시간 PCR을 전기화학적으로 구현하는 것을 목표로 하고 있다. PCR 전에 $Ag^+$는 압타머가 수식된 프라이머와 결합한 상태로 존재한다. 표적 DNA가 존재할 시, 압타머의 상보적인 서열의 DNA를 생성되면서 압타머에 결합되어 있던 $Ag^+$는 용액으로 방출된다. 방출된 $Ag^+$는 높은 확산성을 보이며 전극 표면상 산화환원 반응에 활발히 참가할 수 있고, 이로 인해 증가하는 전기화학 신호를 통하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 본 원리에 기반하여, Enterococcus faecium (E. faecium) genomic DNA (gDNA)를 대상으로 ERT-PCR 모니터링 실험을 진행한 결과, $3.085 x 10^2 copies/\mul$까지 민감하게 검출할 수 있었으며 표적 DNA에 대해 특이적으로 신호를 보이는 것을 확인했다. 본 기술은 전기화학적 분석법의 경제성과 효율성을 겸비한 분자진단 기술로써 최근 주목받는 현장진단기술에 적용할 수 있는 적합한 기술이라 판단된다.
