Herein, we describe a novel enzyme-free and label-free strategy for colorimetric assay of uracil DNA glycosylase (UDG) activity, which relies on a target-activated toehold-mediated strand displacement (TMSD) circuit. The strategy employs a detection probe composed of an uracil-containing strand and a catalyst strand (CS) designed to trigger the TMSD circuit. Thus, in the presence of UDG which cleaves uracil bases and destabilizes the detection probe, CS is released to promote the TMSD reaction. This leads to the liberation of a G-quadruplex DNAzyme strand (GS) with the peroxidase mimicking activity, which is initially caged by a blocker strand. Notably, a fuel strand is supplemented to promote another cycle of TMSD reaction by recycling the CS, which activates a large number of GSs. As a consequence, a distinct colorimetric signal is generated from the oxidation of ABTS by GSs. With this strategy, we selectively determined the UDG activity down to 0.006 U/ml, and also identified its presence with the naked eye. Finally, the practical applicability of this assay was successfully demonstrated by reliably determining UDG activities in human serum.
본 학위논문에서는 비효소, 비표지의 표적 활성 염기가닥 치환 회로를 이용하여 uracil DNA glycosylase (UDG)를 비색적으로 검출하는 방법을 개발하였다. 본 기술에서는 염기가닥 치환 (TMSD) 회로를 유도하기 위해, 우라실 염기가 포함된 가닥과 catalyst 가닥으로 구성된 DNA 이중 가닥 검출 프로브를 도입하였다. UDG 가 존재할 경우, 우라실 염기가 제거됨으로 인해 검출 프로브가 불안정하여 catalyst 가닥이 방출됨으로써 TMSD 회로를 개시한다. 이에 따라 blocker 염기가닥으로 비활성화된 split G-quadruplex DNA 기반 효소가 blocker 염기가닥으로부터 분리되어 활성화된다. 또한, fuel 염기가닥을 이용하여 catalyst 염기가닥을 재발생시켜 TMSD 회로에 여러 차례 재활용한다. 이 결과, peroxidase mimicking activity 를 가진 G-quadruplex DNA 기반 효소의 ABTS의 산화작용으로 인한 강한 비색 신호가 나타난다. 본 기술을 이용하여 0.006 U/ml 의 적은 양의 UDG를 고감도로 검출할 수 있었으며, 비색 변화를 육안으로 직접 확인하였다. 최종적으로, 사람의 혈청에 대해서 UDG 활성을 성공적으로 검출하여 기술의 실용성을 증명하였다.
