Diverse of fluorescent labeling technics has been developed to visualize and help understanding biological roles, dynamics and functions at single cell level [1]. In the last decade nanoscopy or super resolution microscopy (SRM) technics such as STED and STORM has been developed. This has enabled researchers to not visualize the localization but also understanding of biological structure and function in nanoscale (10-30 nm), which previous fluorescence confocal imaging method had a limit of 200 nm [2, 3]. Therefore fluorescence probe that can be labeled by self-labeling enzyme such as Halo, SNAP, CLIP tag has received attention due to about 20 fold higher photophysical properties than fluorescent protein [4]. Various Halotag dye has been developed and among them the green florescence probe that can be used in vivo has not been reported yet. Here I report BODIPY based Halo G that are highly stable in serum for capable in vivo system.
Despite of their relatively large size of fluorescent protein and self-labeling enzyme, they occur only minimal affect in the clustering behavior [5]. However, by small protein such as viral protein could not be labeled due to their sizes [6]. Therefore, I decided to develop a peptide tag and fluorescent probe based on sulfonyl fluoride (SuFEx) click chemistry. The SFP2 dye was developed via phenotypic high-throughput screening (HTS) with BODIPY family that could penetrate and washed out rapidly with minimal background. I found candidates that specifically label specific peptide sequence KYRGQAHDx2 (KYRG2) in vitro. I am also developing in vivo screening method to find soluble and specific to peptide sequence.
Fluorescent probe labeling are not only important for understanding biological dynamics and tracking, but also for diagnosis such as reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS). In low concentrations of ROS can activate the signaling pathways and trigger important cellular proliferation and differentiation but in oxidative stress, high ROS occurs signal transduction and diverse pathological conditions, including Alzheimer’s disease, amyotrophic lateral sclerosis and Parkinson’s disease. Among ROS, superoxide radical anion ($O2^{•−}$) is the major reactive oxygen species (ROS) in living systems. Therefore, I have developed a hemicyanine-embedded diphenylselenide (HemiSe)-based probe for the selective detection of superoxide radical anion. The probe shows excellent sensitivity and selectively towards superoxide and showed “turn-on” fluorescence upon addition of endogenous superoxide in RAW264.7 cells. This unit will be further studied in the context of versatile approaches to detection and therapeutics in neurodegenerative disease research as confirmed by confocal microscope imaging.
생체분자의 역할과 기능 등을 단일 세포 단위로 관찰하기 위해 다양한 형광물질과 라벨링 방법들이 개발 되었습니다 [1]. 지난 10년간 기술의 발전으로 나노 현미경과 STED나 STORN 과 같이 고 분해능 슈퍼 레졸루션 현미경 (SRM) 등이 개발 되어 짐에 따라 기존의 공초점 현미경의 수백 나노미터 보다 수십 나노미터로 더 선명하게 고해상도를 관찰 할 수 있게 되었습니다. 하지만 기존의 형광 양자 수득률이 낮은 형광 단백질 보다는 최대 20배까지 밝은 형광 물질에 사람들은 관심을 가지게 되었고 그 중 형광물질을 부착할 수 있는 자가-라벨링 효소 (Halo, SNAP, CLIP) 같은 단백질이 개발 되었습니다 [4]. 다양한 할로텍 형광 물질이 개발되었으나 생명체 내의 혈청에 서 안정적으로 녹색 파장을 나타내는 물질은 없었습니다. 우리는 BODIPY를 기반으로 혈청에서 매우 안정해서 생명체 내에서 사용 가능 한 한 Hal G를 만들었습니다.
자가-라벨링 효소들은 형광 단백질과 같이 상당히 큰 크기를 가지는데 이들을 단백질에 부착함으로써 단백질 마다 작은 변화를 일으키기도 하며 바이러스 단백질 처럼 훨씬 작은 단백질은 발현에도 문제가 생기는 경우가 있습니다 [5]. 따라서 FLAG 이나 HA 처럼 하지만 형광 물질을 부착하여 대중적으로 사용할 수 있는 펩타이드 텍을 개발하고자 하였습니다. 우리는 클릭 화학으로 사용되는 술포닐플로라이드 (SuFEx) 기반 형광물질은 SFP2 를 개발 하였습니다. 우리는 생체외 라이브러리를 통해 SFP2가 특이적으로 붙는 KYRGQAHDx2 (KYRG2) 펩타이드 서열을 찾아내었습니다. 또한 생채내에서 좀 더 안정하게 발현되는 펩타이드 서열을 검출할 수 있는 스크리닝 방법을 개발하고 있습니다.
형광 물질은 단지 세포내의 위치와 역할을 보는것 뿐만 아니라 세포 내의 활성 산소 (ROS/RNS) 같은 것을 진단하는 곳에도 사용이 가능합니다. 활성산소 등은 생체 내에 소량 존재 하지만 과량으로 존재 시 알츠하이머, 파킨슨, 루게릭 병을 일으킬 수 있습니다. 우리는 그 중 과산화물 음이온 ($O2^{•−}$) 에 특별하게 반응하는 형광 물질인 셀레늄기반 HemiSe를 찾아내었고 살아있는 세포 내에서 외부에서 추가로 넣어주는 과한화물 음이온 뿐만 아니라 내부의 과한화물 음이온을 관찰 할 수 있었습니다. 이 물질은 향 후 병의 진단과 위치를 나타내는 사용 될 수 있을 것이라 생각 되어집니다.
