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Application of single crystalline Au nanowire for injection of genetic information = 유전적 정보의 주입을 위한 단결정성 금 나노선의 응용
서명 / 저자 Application of single crystalline Au nanowire for injection of genetic information = 유전적 정보의 주입을 위한 단결정성 금 나노선의 응용 / Kkotchorong Park.
저자명 Park, Kkotchorong ; 박꽃초롱
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2019].
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초록정보

During several decades, nanomaterials have achieved outstanding results in various research fields due to their intrinsic properties such as electrical, optical, mechanical properties and their nano dimension. Among diverse nanomaterials, gold (Au) nanostructures including Au nanoparticles, Au nanorods, Au nanowires and so on have some advantages; high biocompatibility, facile surface modification through gold-sulfur interaction, chemical inertness and high-reproducibility in synthetic process. Therefore, the Au nanomaterials have been valuable tools for biological application such as imaging, sensing, gene and drug delivery, and analysis of cellular behavior. Especially, due to their high biocompatibility and membrane permeability, Au nanomaterials have been used to efficiently deliver a sort of cargos in living cells such as siRNA, nucleic acids, and drugs. Especially, recent studies have reported that nanowires can significantly improve the efficiencies of biochemical processes. Because nanowires (NWs) can transport electrical and optical signals/stimuli and biomaterials into living organisms, they can form nano-sized functional biointerfaces. Particularly, the NWs can reach a specific target in a cell or tissue with nanoscale spatial resolution and minimize the invasiveness owing to ultrathin diameters. In this dissertation, synthesis of single-crystalline 1-dimensional Au nanowire by chemical vapor deposition (CVD) and application of a fabricated Au NW injector (Au NWI) as a biological nanomaterial are reported. By introducing the Au NWI for injection of genetic information into mouse embryos or porcine spermatogonial stem cells (pSSCs), which is a first step for producing transgenic animals, it achieves improved results compared with conventional methods for injecting genetic information. This dissertation consists of as follows. Chapter 1 demonstrates a synthesis method of single-crystalline 1-dimensional Au nanowires (Au NWs) by chemical vapor transport method and electrochemical, mechanical and structural characteristics of the Au NWs. In addition, it describes the fabrication process of Au NW injector (Au NWI) for biological application of 1-dimensional single-crystalline Au NWs as a nano-biomaterials and electrochemical properties of the fabricated Au NWI. In chapter 2, the development of nanoinjection system by introducing a 1-dimensional Au NWI for delivering plasmid into the pronucleus of a mouse embryo is reported. Since a zygote, which is a fertilized 1-cell stage embryo, has two physical barriers (cytoplasmic membrane and zona pellucida), the direct delivery of plasmids into a zygote pronucleus (PN) is more difficult than other mammalian cells. To direct delivery of the exogenous gene into a PN of an embryo, a glass capillary which has μm diameter has been generally used. However, it could induce physical damages on embryos by a quite thick diameter. In addition, the chemical damages could be induced by a chemical buffer solution which is delivered with plasmids. On the other hand, a Au NWI can directly deliver exogenous genes into the PN of an embryo by applying an electric pulse without using the extracellular buffer. To penetrate the two physical barriers with minimal disruption of the embryo, I defined the optimal diameter and length of the Au NWI. By using the optimized Au NWI, a green fluorescent protein (GFP)-encoding plasmids were delivered and the expression of GFP was confirmed in blastocysts stage embryos. It was found that the mosaicism highly reduced in the Au NWI injected embryos compared with the micropipette injected embryos. Since the frequent occurrence of the mosaicism has been a very important issue in the efficient production of the transgenic mouse, this result suggests that our Au NWI can improve the delivery efficiency with suppressed mosaicism and it can become very useful nano-biomaterial. Chapter 3 demonstrates a successful genetic modification of porcine spermatogonial stem cells (pSSCs) via an electrically responsive Au nanowire injector (E-R Au NWI). In this study, pSSCs were adopted as an exogenous gene carrier. The SSCs can self-renew infinitely and differentiate into sperm cells through spermatogenesis in the seminiferous tubule of the testis. As a result, the genetically modified pSSCs can be a highly useful vehicle for transmitting transformed genetic traits to the next generation and moreover, they can achieve efficient germline transmission, resulting in efficiently producing transgenic animals. The E-R Au NWI can noninvasively interface with the nucleus of the pSSC. It can directly deliver plasmid into the nucleus by applying an electrical stimulus. After 1 day from the delivery, successful expression of the GFP was confirmed and maintenance of SSC characteristic was confirmed by analyzing a GFRα1 which is a SSC-specific marker. Especially, when compared to the transfection efficiencies of conventional nonviral vector-based gene delivery methods such as jetPEI, Lipofectamine, and electroporation, the E-R Au NWI-based method improved the pSSC transfection efficiency by at least 6.7-fold and even up to 46.7-fold. Furthermore, transgenic pSSCs containing the human bone morphogenetic protein 2 gene were successfully obtained by using E-R Au NWIs. This result suggests that the E-R Au NWI enables the efficient genetic modification of pSSCs and can be employed to produce diverse kinds of transgenic pigs.

수 십 년 동안 나노물질들은 그들 고유의 전기적, 광학적, 기계적 특성에 의해 다양한 연구 분야에서 뛰어난 결과들을 성취해왔습니다. 많은 나노물질들 중 금 나노구조들은 높은 생체 적합성, Au-S 결합을 통한 표면 개질의 용이성 및 합성 과정의 높은 재현성 등 다양한 장점들을 갖기 때문에 이미징, 센서, 유전자 및 약물 전달 및 세포 특성 분석 등 여러 연구 분야에서 유용한 재료로써 응용되어 왔습니다. 특히, 최근 여러 연구들에서 나노선들이 다양한 생화학적 과정들에 대한 효율들을 상당히 향상시킬 수 있음이 보고되었는데, 나노선들은 전기적/광학적 자극 및 신호를 살아있는 유기체에 전달할 수 있고, 나노 사이즈의 기능적 바이오인터페이스를 형성할 수 있기 때문입니다. 더 나아가, 나노선은 높은 공간 분해능을 가지므로 세포 또는 조직 내 특정 위치에 도달할 수 있습니다. 이 학위 논문은 화학 기상 이송법에 의한 단결정성 1차원 금 나노선의 합성과 제작된 금 나노선 인젝터의 나노재료로서의 응용에 대해 보고합니다. 금 나노선을 형질전환 동물(마우스, 돼지) 제작을 위한 첫 번째 단계인 쥐 수정란 및 돼지 정원줄기세포 핵 내 유전적 정보의 주입을 위한 나노선 인젝터로 적용함으로써 기존의 유전자 주입 기술 대비 유전자 발현 효율의 향상 및 세포 손상 감소 등의 결과를 도출할 수 있었습니다. 이 학위논문은 다음과 같이 구성되어 있습니다. 제 1장은 화학 기상 증착법에 의한 1차원 단결정성 금 나노선의 합성법 및 금 나노선의 우수한 특성에 대해 설명합니다. 또한 단결정성 금 나노선의 바이오재료로서의 응용을 위한 금 나노선 인젝터의 제작 과정과 제작된 금 나노선 인젝터의 특성을 설명합니다. 제 2장에서는 마우스 수정란 내 물질전달에 1차원 금 나노선 인젝터의 도입을 위한 나노인젝션 시스템의 개발에 대해 설명합니다. 또한, 금 나노선 인젝터 도입에 의해 향상된 유전자 전달 효율 및 뛰어난 모자이즘의 억제에 대해 보고합니다. 수정란은 2 개의 물리적 장벽들 (세포막, 투명대) 을 갖기 때문에 수정란의 전핵에 외래유전자를 직접 전달하는 것은 일반 세포보다 난이도가 높습니다. 수정란 핵 내 직접적인 물질전달을 위해 주로 μm 사이즈의 유리모세관이 사용되었는데, 다소 굵은 직경은 수정란에 물리적 손상을 유도할 수 있고 유전 물질과 함께 전달되는 화학적 용액에 의해 수정란에 화학적 손상을 야기할 수 있습니다. 반면 금 나노선 인젝터는 전기적 펄스에 의해 세포 외액의 사용 없이 외래유전자를 수정란의 전핵 내로 직접 전달할 수 있습니다. 먼저, 우리는 수정란의 손상을 최소화하면서 물리적 장벽들을 통과할 수 있는 금 나노선의 최적의 디멘젼을 정의하였습니다. 최적화된 금 나노선 인젝터를 이용하여 녹색 형광 단백질이 암호화된 유전자를 전달하여 배반포 단계에서 녹색 형광 단백질의 발현을 확인하였습니다. 특히, 금 나노선 인젝터에 의해 수정란 내 모자이즘 발생이 매우 감소한 것을 알 수 있었습니다. 빈번한 모자이즘의 발생은 효율적인 형질전환 마우스 제작을 방해하는 매우 중요한 요소였기 때문에, 본 연구 결과는 금 나노선 인젝터가 모자이즘을 억제하면서 수정란 내 유전자 전달의 효율을 향상시킬 수 있는 대체 유전자 주입 기술 및 유용한 나노바이오재료가 될 수 있음을 시사합니다. 제 3장에서는 금 나노선 인젝터에 의한 돼지 정원 줄기세포 (porcine spermatogonial stem cells, pSSCs) 의 성공적인 유전적 변형을 보고합니다. 우리는 외래유전자의 수송체로 pSSCs 를 사용하였습니다. 정원 줄기세포 (SSC) 는 남성 생식 줄기세포 중 하나로, 평생 동안 정소 내 세정관에서 자가증식이 가능하며 일련의 정자 형성 과정을 통해 정자로 분화 가능한 세포입니다. 따라서, 유전적으로 변형된 pSSCs 는 변형된 형질을 다음 세대로 전달할 수 있는 유용한 수송체가 될 수 있으며, 더 나아가 생식선 전이를 가능케 하므로써 효과적인 형질전환 동물 제작을 가능하게 할 수 있습니다. 전기적 자극에 반응하는 금 나노선 인젝터는 pSSCs 의 손상을 최소화하면서 세포 핵에 비침습적으로 접근합니다. 전기적 자극 인가에 의해 핵 내로 유전자를 직접 전달하였고, 하루 뒤 녹색형광단백질의 성공적인 발현과 SSC 특이적 마커인 GFRα1 의 분석을 통해 인젝션 후 SSC 의 특성이 잘 유지됨을 확인하였습니다. 특히, 종래에 많이 사용되는 jetPEI, lipofectamine, electroporation 과 같은 비바이러스성 벡터 기반의 유전자 전달 방법들과 비교하였을 때 금 나노선 인젝터는 pSSC 형질전환 효율을 최소 6.7 배에서 최대 46.7 배 향상시켰습니다. 더 나아가, 우리는 인간 골 형성 유도 단백질 2 유전자를 포함하는 형질전환 pSSCs 를 성공적으로 획득하였습니다. 이 결과는 금 나노선 인젝터가 pSSCs 의 효율적인 유전적 변형을 가능케 하며 다양한 종류의 형질전환 된 정원줄기세포의 제작을 가능케 하고 더 나아가 형질전환 돼지 생산에 적용될 수 있음을 시사합니다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCH 19005
형태사항 viii, 120 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 박꽃초롱
지도교수의 영문표기 : Yongwon Jung
지도교수의 한글표기 : 정용원
수록잡지명 : "Suppressing mosaicism by Au nanowire injector-driven direct delivery of plasmids into mouse embryos". Biomaterials, 138, pp.169-178(2017)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과,
서지주기 References : p. 96-115
주제 gold nanowire
single crystalline
chemical vapor deposition
gene delivery
transgenic animal
금 나노선
단결정
화학 기상 증착법
유전자 전달
형질전환 동물
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