IFN-mediated innate immune response represents the first line of defense against virus infection. There are three distinct interferon (IFN) families based on their structures and receptor complex. Type I IFNs include 13 IFN-$\alpha$s, IFN-$\beta$, IFN-$\omega$, IFN-$\varepsilon$, and IFN-$\kappa$ and they bind a heterodimeric transmembrane receptor composed of IFNAR1 and IFNAR2 subunits. IFN-$\gamma$ is a single member of type II IFN and its receptor is composed of IFNGR1 and IFNGR2. Type III IFNs, which were discovered in 2003, include IFN-$\lamda$1 (IL-29), IFN-$\lamda$2 (IL-28A), and IFN-$\lamda$3 (IL-28B). Recently, IFN-$\lamda$4 which is encoded on upstream region of IFNL3 on chromosome 19 was identified as a new member of type III IFNs. Type III IFNs exert their biological activity via a receptor complex that comprises the unique IFN$\lamda$R1 and IL-10R2 chain. Also, IFN-$\beta$ and IFN-$\lamda$s are known to be produced in virus infected cells.
In 2013, the IFNL4 gene which encodes IFN-$\lamda$4 was identified on upstream region of IFNL3 locus during GWAS with HCV infected patients. Interestingly, the production of functional IFN-$\lamda$4 is determined by germline dinucleotide frameshift variant in exon 1 of IFNL4 gene (rs368234815). While the rs368234815-$\delta$G allele produces the full-length IFN-$\lamda$4 protein by one of transcript variant, rs368234815-TT allele cannot make IFN-$\lamda$4 because of premature stop codon. In addition, this rs368234815-$\delta$G/TT allele is the strongest genetic marker to predict responsiveness to pegylated IFN-$\alpha$ based therapy. So current study is focused on the underlying mechanism of IFN-$\alpha$ unresponsiveness in HCV infected patients with rs368234815-$\delta$G allele.
Although Type I and III IFN binds to different receptor complex, both signaling results in activation of IFN-stimulated gene factor 3 (ISGF3) composed of phosphorylation of signal transducer and activator of transcription (STAT1), phosphorylated STAT2, and interferon regulatory factor 9 (IRF9). ISGF3 enters into nucleous and binds to IFN-stimulated responsive element (ISRE) in the promoter of the ISGs.
Using primary human hepatocytes and hepatoma cell lines, it was demonstrated that HCV infection induced IFN-$\lamda$4, which cause unresponsiveness to exogenous IFN-$\alpha$ treatment. It was reported that the gene expression of ISG15, one of the ISGs, was upregulated in HCV-infected liver and the expression level in the liver was higher in future nonresponder to pegylated-IFN-α based therapy than responder. Intracellular free ISG15 blocks SKP2 dependent degradation of USP18, which is an well-known negative regulator of type I IFN signaling, by preventing the ubiquitination of USP18 protein in human. Based on these previous reports, further study was done about the effect of IFN-$\lamda$4 on IFN-$\alpha$ responsiveness. It was proven that IFN-$\lamda$4 induced ISG15 stabilize the protein level of USP18, which is responsible for IFN-$\alpha$ unresponsiveness.
HCV infection is currently treated with DAA, which directly targets different viral protein. So, the effect of DAAs on the IFN-$\lamda$4 expression and responsiveness to IFN-$\alpha$ treatment was examined. DAA treatment to HCV infected PHH reduced the intracellular HCV RNA titer, causing dramatically attenuated the gene expression of IFN-$\lamda$4 as well as IFN-$\lamda$1. As the expression of IFN-$\lamda$s including IFN-$\lamda$4 is decreased by treatment of DAA, the unresponsiveness to IFN-$\alpha$ became restored. The data suggest that DAA treatment might be beneficial in combination with pegylated-IFN-$\alpha$ based therapy as rescue treatment of DAA-failed patients.
Unlike other IFNs, the secretion of IFN-$\lamda$4 is impaired, which in not due to a weak signal peptide. This property of poor secretion limits further investigation about IFN-$\lamda$4. Commercially available IFN-$\lamda$4 is purified from E.coli inclusion body through process including unfolding and refolding which might cause lack of proper protein folding. Also, recombinant IFN-$\lamda$4 protein without post translational modification, which is important process in mammalian cells cannot reflect biophysical properties of IFN-$\lamda$4.
In this study, to improve the secretion of IFN-$\lamda$4, de novo N-glycosylation sites were introduced to of IFN-$\lamda$4 sequence using the structure based glycoengineering approach. Fianlly IFN-$\lamda$4 can be purified from the culture supernatant by de novo N-glycosylation introduction. In addition, de novo N-glycosylation-introduced IFN-$\lamda$4 mutants provide stronger bioactivity including activation of JAK-STAT pathway and antiviral effect in viral infection model than commercially available IFN-$\lamda$4 from E.coli. Considering that activity of IFN-$\lamda$4 tends to be rapid, but transient compared to IFN-$\lamda$1, -$\lamda$2, and –$\lamda$3, de novo N-glycosylation-introduced IFN-$\lamda$4 mutants might be candidates for therapeutic or clinical application.
인터페론 반응은 바이러스 감염 시 최초로 활성화되는 항바이러스성 면역반응이며 현재까지 사람에서 세 종류의 인터페론이 규명되었다. 제 1형 인터페론에는 인터페론 알파, 베타가 속해있고 인터페론 알파 수용체1과 인터페론 알파 수용체2로 이루어진 복합체에 결합해서 작용한다. 제 2형 인터페론은 인터페론 감마가 단독 단백질로 속해있으며 인터페론 감마 수용체1과 인터페론 감마 수용체2로 이루어진 복합체를 통해 작용한다. 2003년에 제 3형 인터페론에 속하는 단백질로서 인터페론 람다1, 2, 3가 발견되었다. 이후 2013년에 인터페론 람다-3의 상류 유전자 서열에서 인터페론 람다4가 존재한다는 것이 보고되었다. 제 3형 인터페론은 인터페론 람다 수용체1과 인터루킨-10 수용체2로 이루어진 복합체에 결합해서 작용한다. 이 중 바이러스에 감염된 세포에서는 인터페론 베타와 제 3형 인터페론이 생성되어 항바이러스성 면역반응을 나타낸다.
인터페론 람다4는 C형 간염 바이러스 환자의 인터페론 알파 치료에 대한 반응성을 결정짓는 유전자 서열분석을 통해 발견되었다. 인터페론 람다4의 대립유전자 rs368234815가 $\delta$G형일 경우 효과적인 인터페론 람다4가 생성되고 대립유전자 rs368234815가 TT형일 경우 종결코돈에 의해 효과적인 인터페론 람다4가 생성되지 않는다. 또한 인터페론 람다4의 유전형이 ΔG인 환자의 경우 인터페론 람다4의 유전형이 TT인 환자보다 인터페론 알파 치료 반응성이 좋지 않았다. 본 연구는 인터페론 람다4의 유전형이 ΔG인 환자가 어떠한 기전으로 인터페론 알파 치료에 대한 반응성이 떨어뜨리는지를 알아보고자 연구를 진행하였다.
제1형 인터페론과 제 3형 인터페론은 각각 다른 수용체에 결합해서 작용하지만 두 형 모두 동일한 하위 신호 전달 단백질을 활성화시킨다. 하위에 활성화 되는 신호 전달 단백질로서 인산화된 signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1), 인산화된 STAT2. Interferon-regulatory factor (IRF9) 로 이루어진 interferon-stimulated gene factor 3 (ISGF3)가 핵 안으로 들어가 인터페론자극유전자 (interferon-stimulated gene, ISG)의 발현을 증가시킨다.
인간 유래의 1차 간세포와 간세포주를 이용해 C형 간염 바이러스를 감염이 인터페론 람다4를 생성시키며, 인터페론 람다4에 의해 외부 인터페론 알파 자극에 대한 반응성이 떨어지는 것을 확인하였다. ISG15는 인터페론 자극의 하위 신호 전달에 의해 발현되는 인터페론자극유전자 중의 하나인데, 인터페론 알파 치료 반응성이 좋지 않은 C형 간염 바이러스 환자의 간에서 interferon-stimulated gene 15 (ISG15)의 유전자 발현이 증가되어 있음이 알려져 있었고, 세포 내에서 다른 단백질과 결합하지 않고 세포 밖으로 분비되 않은 단독 상태로 존재하는 ISG15가 제 1형 인터페론의 신호를 저해하는 USP18 단백질을 안정화시킨다는 것이 보고되어 있었다. 이것을 바탕으로 연구를 진행한 결과, 인터페론 람다4에 의해 인터페론 알파 자극에 대한 반응성이 떨어지는 요인으로 인터페론 람다4가 발현시키는 ISG15와 그것이 안정화시키는 USP18 단백질이 작용함을 알 수 있었다.
인터페론 알파 치료제가 지난 25년 동안 C형 간염 바이러스의 치료제로서 사용되었지만 현재는 바이러스 C형 간염 바이러스 단백질에 직접적으로 작용하는 Direct Acting Antiviral (DAA)가 사용되고 있다. DAA 처리가 인터페론 알파 자극에 대한 반응성을 조절하는지를 알아보기 위해 인간 유래의 1차 간세포에 C형 간염 바이러스를 감염시킨 후 DAA를 처리했더니, 바이러스 복제와 인터페론 람다4의 발현이 감소하면서 인터페론 알파 자극에 대한 반응성이 복원되는 것을 확인하였다. 이는 DAA 치료제가 인터페론 알파 치료제의 반응성을 복원시킬 수 있으며 DAA 치료에 저항성을 가진 C형 간염 바이러스 감염에 DAA 치료제가 알파 치료제와 복합적으로 사용될 수 있음을 시사한다.
다음으로, 인터페론 람다4가 다른 인터페론들과 구분되는 특징은 세포 밖으로 분비가 거의 이루어지지 않는다는 점이다. 세포 밖으로 잘 분비되지 않는 특성은 인터페론 람다4의 연구를 크게 제한한다. 현재 판매되는 인터페론 람다4는 대장균의 내포체에서 추출한 후 단백질의 구조를 재접힘 시킨 것이며 대장균에서 추출한 단백질에는 포유류에서 일어나는 단백질 번역 후 변형이 전혀 포함되어 있지 않다. 따라서 현재 판매되는 인터페론 람다4는 단백질의 고유한 특성을 연구하기에는 한계점이 많다.
이 한계를 극복하기 위해 단백질 모델링을 이용해서 단백질공학 중 하나인 N-글리코실화가 일어나는 단백질 서열을 인터페론 람다4에 추가적으로 도입하였다. N-글리코실화가 일어나는 단백질 서열을 추가적을 도입한 인터페론 람다4는 포유류 세포에서 분비가 되는 것을 확인하였다. 또한, 현재 판매되는 대장균 유래의 인터페론 람다4보다 강력하게 하위 신호를 전달하고 더 효율적인 항바이러스 효과를 나타내는 것을 확인하였다.또한 인터페론 람다4가 다른 제 3형 인터페론과는 달리 자극에 의한 반응이 더 빠르게 일어난다는 특성을 반영하여 N-글리코실화가 일어나는 단백질 서열을 추가적으로 도입한 인터페론 람다-4를 치료제의 후보로도 고려해볼 수 있을 것이다.
