An attached cultivation system has been receiving much attention as a breakthrough in microalgae cultivation technology. Attached cultivation generates a high concentration of biomass in the form of a biofilm, which significantly reduces the risk of contamination, the cost of harvesting and dewatering, and the amount of space required for cultivation. In this study, attached cultivation of green microalga species, Ettlia sp., was evaluated for lipid production. Firstly, an attached cultivation system, driven by diffusion of medium through a porous membrane where a biofilm is attached, was developed and used throughout the entire study. A novel wet measurement method for more accurate biofilm growth analysis was developed and successfully estimated the weight of dry biomass without sacrificing samples. The optimum initial conditions for seed culture age and inoculum density for attached cultivation were found to be day 4 for seed age and $2.5 \pm 0.5 g/m^2$ for inoculum density. By employing response surface methodology, optimization of light intensity and $CO_2$ concentration for surface biomass and lipid productivity was achieved. A maximum surface biomass productivity of $28.0 \pm 1.5 g/m^2$/day was achieved at 730 $\mu E/m^2$/s with 8% $CO_2$. The maximum surface lipid productivity was $4.2 \pm 0.3 g/m^2$/day at 500 $\mu E/m^2$/s with 7% $CO_2$. The lipid content of biofilm decreased as the light intensity increased due to proliferation of biomass with low lipid content in the middle of the biofilm at high light intensity. In order to understand the composition variation within the biofilm, layer by layer analysis of microalgal biomass was conducted using a different concentration of nutrients in the feeding media. The effect of nitrate and phosphate concentration on biomass and lipid productivity showed that a high concentration of nutrients did not improve biomass productivity, while a low phosphate concentration improved lipid content of biomass up to 30%. A nutrient starvation strategy was employed and evaluated to enhance lipid productivity. Although lipid content increased under nutrient depletion, overall lipid productivity under nutrient-replete conditions was highest with $4.9 \pm 0.5 g/m^2$/day on day 6. This was due to high lipid accumulation in the top layer of the biofilm even when a nutrient was sufficiently supplied. Ultimately, natural polarization of bio-composition is due to light and nutrient concentration gradients. In order to evaluate the feasibility of large-scale outdoor attached cultivation of Ettlia sp. for lipid production, solar irradiation on the Microalgae-Attached Panel (MAP) was simulated and a yearly average footprint biomass productivity was estimated and optimized. A double-side MAP design facing east/west offered the highest footprint biomass productivity with the 0.4m distance between the vertical panels during all season. Yearly average footprint biomass productivity of 25 g/$m^2$/day was achieved with the panel height of 3.4 m. This is equivalent to 60 tons of dry biomass/ha/yr, 9 to 15 tons of lipid/ha/yr (15% to 25% of lipid content), 420 to 600 kgs of lutein/ha/yr (0.7% to 1%), and 108 tons of $CO_2$/ha/yr (carbon content of 50% of biomass). In conclusion, attached cultivation of Ettlia sp. for lipid production has great potential for large-scale outdoor systems both economically and environmentally.
최근 들어 $부착 배양^{Attached cultivation}$ 기술은 기존 부유식 기반의 미세조류 배양 기술의 한계를 극복해 줄 수 있는 해결책으로서 각광받고 있다. 부착 배양을 통하여 배양하는 바이오매스는 고농도의 바이오필름 형태로 배양 하여 오염에 대한 위험도, 수확 및 탈수 비용, 그리고 배양 규모를 현저히 낮출 수 있다. 본 연구에서는 녹조류 $에틀리아^{Ettlia sp.}$의 부착 배양을 통한 지질 생산을 주제로 연구하였다. 가장 먼저 바이오필름이 부착 하여 자라는 다공성막을 통한 확산에 의한 배지 공급으로 운영되는 부착 배양 시스템을 개발 및 제작하여 본 연구의 모든 실험에 사용하였다. 또한 좀더 정밀하게 바이오필름 성장을 측정하기 위하여 새롭게 습식 무게 측정법을 개발하였고 이를 통하여 더 이상 샘플을 매번 희생하지 않고 지속적으로 배양하며 성장 분석을 병행할 수 있게 되었다. 부착 배양 실험을 위한 초기 조건 중 최적의 시드 조건과 초기접종농도를 각각 4일차 시드와 $2.5 \pm 0.5 g/m^2$ 의 접종 농도로 확인하였다. 다음으로 광합성 배양에 중요한 환경 요소인 빛과 이산화탄소의 농도를 바이오매스 생산성과 지질 생산성에 대해 반응표면분석법 (Response Surface Methodology, RSM)을 도입하여 최적화를 하는 연구를 진행하였다. 최대 표면 바이오매스 생산성은 $28.0 \pm 1.5 g/m^2$/day 로 빛 $730 \mu E/m^2$/s와 $CO_2$ 농도 8%에서 나타났다. 최대 표면 지질 생산성Surface biomass productivity은 $4.2 \pm 0.3 g/m^2$/day로 빛 $500 \mu E/m^2$/s와 $CO_2$ 농도 7%에서 나타났다. 일반적으로 부유식 배양에서 보이는 현상과 달리 바이오필름의 지질 함량은 빛이 증가할수록 감소하는 경향을 보였는데 이는 공정 되어서 자라는 특성으로 인하여 강한 빛을 받는 부분이 바이오필름의 상층으로 국한되고 그 밑으로 빛의 새기가 희석되어 적절한 양의 빛을 받게 된다. 이로 인하여 강한 빛에서도 바이오매스가 부분적으로 더 성장하며 이때 바이오매스의 지질 함량이 낮기 때문에 전반적으로 지질 함량이 낮아지게 된다. 바이오필름의 단층 분석을 통하여 이를 더 정확히 확인해 보았다. 이 실험에서 단층 별 양분의 농도 기울기가 어떻게 일어나고 있는지 알기 위해 주요 양분인 질소와 인의 농도를 달리하여 실험하였다. 그 결과 질소와 인 모두 일정 농도 이하에서 바이오매스 성장에 저해를 보였고, 그 이상부터는 크게 증가하지 않았다. 하지만 인의 농도 같은 경우 낮은 농도에서 지질 함량이 약 30% 가량 크게 증가하는 것을 확인하였다. 이를 기반으로 양분 결핍 전략을 적용해 지질 함량의 증대를 도모하여 보았다. 그 결과 양분이 결핍된 조건에서 지질 함량이 약 25%대로 증가하는 모습은 보였으나 바이오매스 성장에서 저해를 보였고, 반면 양분이 충분한 조건에서는 지질 함량 20%정도 유지하면서 바이오매스가 최대로 성장하는 모습을 보이며 결과적으로 가장 높은 지질 생산성인 4.9±0.5 g/$m^2$/day를 6일차에 달성하였다. 이는 이전에 언급된 현상, 즉 양분이 충분히 공급되는 상황에도 바이오필름 상층부에 높은 지질 함량을 보였기 때문 이였다. 결국, 바이오필름 내 빛과 양분의 농도 기울기로 인하여 지질을 포함한 구성요소들이 자연적 $편극현상^{Natural Polarization}$이 일어남을 확인 하였다. 마지막으로 에틀리아의 부착 배양이 옥외 대량 지질 생산에 적합한지를 확인해보기 위해 미세조류 부착 판 (Microalgae-Attached Panel, MAP)에 도달하는 태양광을 실시간으로 $시뮬레이션^{Simulation}$ 하여 연 평균 지표 면적당 바이오매스 $생산성^{footprint biomass productivity}$을 예측하고 최적화 하였다. 그 결과 동/서 방향을 바라보는 양면 부착 판을 90도로 세우고 0.4m 간격으로 두었을 때 가장 높은 연 평균 지표 면적당 바이오매스 생산성이 나오는 것을 확인하였다. 부착 판의 높이를 3.4m로 하였을 때 25 g/$m^2$/day의 연 평균 지표 면적당 바이오매스 생산성을 달성할 수 있었다. 이는 토지 1 hectare 에서 연간 약 60톤의 바이오매스와 9에서 15톤의 오일 (지질 함량 15%에서 25% 기준), 420에서 600 킬로그램의 루테인Lutein (루테인 함량 0.7% 에서 1% 기준), 그리고 약 108톤의 이산화탄소를 활용할 수 있는 수치이다. 이로서 에틀리아의 부착 배양을 통한 지질 생산은 경제적으로나 환경 적으로 모두 대규모 옥외 시스템에 큰 잠재력을 가지고 있음을 확인 하였다.
