Fibronectin is a crucial component of the extracellular matrix and has been considered as an Epithelial-Mesenchymal Transition marker protein and changes in its expression have been correlated with pathological progression of different types of cancers. Using the triple-negative breast cancer cell line, MDA-MB-231 and its derivative LM2 that preferentially metastasizes to lung, I find up-regulated messenger RNA and protein level of fibronectin when the cells are grown as multicellular spheroids in 3-dimensional (3D) culture system for 48hr, compared with that of 2D monolayer culture system. In addition, I find the levels of integrin $\beta$-1, $\beta$-3, and $\beta$-5 known fibronectin receptors also showed increase protein levels in 3D. Knock-down of fibronectin with siRNA reduced the rate of attachment of both cells and migration of parental cells when cells were transferred from 3D to 2D surfaces. In addition attachment rate of the cells treated with siRNA against integrin $\beta$-5 siRNAs were also reduced on fibronectin Ⅳ coated plates as well as uncoated culture plates, suggesting that integrin $\beta$-5 is important for cell attachment. I also find that Src plays a role in cell attachment because treatment of cells with the Src inhibitor SU6656 caused a decrease in the cell attachment when cells were transferred from 3D to 2D conditions. In addition, it was observed that snail was increased in 3D and transfection with siRNA against snail downregulates of attachment rate of cells from 3D to 2D in MDA-MB-231-LM2 cells. With these experimental results, I suggest that increased expression of fibronectin in 3D conditions provides advantages to circulating tumor cells for the attachment of cells to 2D surfaces to find a new metastatic niche. Furthermore Src and integrin $\beta$-5 may represent important targets to block metastasis.
EMT 표지 단백질이자 세포외기질의 중요한 구성성분인 Fibronectin은 다양한 암의 병리학적 변화와 깊은 상관관계가 있다. 본 연구는 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer) 세포주인 MDA-MB-231 세포와 폐 전이 특성을 보이는 아군인 MDA-MB-231-LM2 세포를 이용하여 각 세포들의 Fibronectin의 전령RNA와 단백질의 발현 수준이 2D 배양 환경에 비해 3D 배양 환경에서 생장 시 특이적으로 증가한다는 사실은 보고한다. Fibronectin과 상호작용하는 세포 표면 수용체인 Integrin $\beta$-1, Integrin $\beta$-3, 그리고 Integrin $\beta$-5의 단백질 발현량 또한 3D환경에서 함께 증가한다는 사실이 관찰되었다. RNA 간섭 (RNA interference) 을 통한 Fibronectin의 발현의 하향 조절 실험을 통해, 3D에서 자란 세포들이 이차원적 표면을 만났을 때 증가한 Fibronectin의 발현에 의해 세포의 부착률과 이동성이 증가됨을 보여주었다. 추가적으로, RNA 간섭을 통한 integrin $\beta$-5의 하향 조절은 Fibronectin Ⅳ가 코팅된 배양유리의 표면으로의 세포 부착률을 감소시켰고, 이러한 관찰 사실은 Integrin $\beta$-5가 3D에서 증가된 Fibronectin과의 상호작용에 중요함을 나타낸다. 또한, 다양한 세포 신호전달 단백질들의 이산화 수준이 3D에서 감소되는 것과 달리, 원발암유전자로 알려진 Src의 인산화는 3D배양환경에서 감소하지 않음과 EMT를 조절하는 전사인자인 Snail이 3D배양조건에서 발현이 증가됨을 발견하였다. 이에, Src에 대한 특이적 억제자인 SU6656처리하여 Src의 활성을 감소시키고, RNAi를 통하여 Snail의 발현을 하양 조절하였다. Src의 활성 억제는 MDA-MB-231 parental과 MDA-MB-231-LM2 두 세포 모두에서 Fibronectin이 코팅된 2D 배양 유지에 대한 부착률을 감소시켰으며, Snail 하향 조절은 MDA-MB-231-LM2 의 부착률에만 영향을 미쳤다. 따라서, 본 연구는 3D 배양조건에서 특이적으로 증가하는 Fibronectin이 세포의 이차원적 표면에 재부착시 Integrin $\beta$-5, Src, 그리고 Snail과 함께 작용한다는 것을 밝히며, 이러한 결과는 순환계에 존재하는 전이성 암세포가 새로운 전이기관을 발견하고 착근하는데 세포외기질의 발현 변화의 이점을 취한다는 것을 시사한다.
