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Studies on N-glycosylation of therapeutic Fc-fusion protein in recombinant CHO cells under stressful culture conditions = 스트레스 배양환경에 따른 재조합 CHO 세포에서 치료용 Fc 융합 단백질의 N-당쇄화에 관한 연구
서명 / 저자 Studies on N-glycosylation of therapeutic Fc-fusion protein in recombinant CHO cells under stressful culture conditions = 스트레스 배양환경에 따른 재조합 CHO 세포에서 치료용 Fc 융합 단백질의 N-당쇄화에 관한 연구 / Jong Hyun Lee.
저자명 Lee, Jong Hyun ; 이종현
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2019].
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초록정보

Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used mammalian host for producing therapeutic glycoprotein because of their ability to produce proteins with post-translational modifications suitable for clinical use. Glycosylation can affect the efficiency, bioactivity, solubility, and in-vivo stability of a glycoprotein. One of the main challenges in bioprocess development for therapeutic glycoprotein is to maintain high productivity while also obtaining good quality. Therefore, to achieve a consistent glycosylation profile (reduction of glycosylation heterogeneity) in the production of therapeutic proteins, a detailed understanding of the glycosylation biosynthetic pathway in the bioprocessing is necessary. To understand the effects of hyperosmolality on protein glycosylation, recombinant CHO cells producing the Fc-fusion protein were cultivated in the hyperosmolar medium. The hyperosmotic culture increased specific Fc-fusion protein productivity but decreased the proportion of acidic isoforms and sialic acid content of the Fc-fusion protein. Expression of 52 N-glycosylation-related genes was assessed by the NanoString nCounter system. N-linked glycan analysis by anion exchange and hydrophilic interaction HPLC showed that the proportion of highly sialylated (di-, tri-, tetra-) and tetra-antennary N-linked glycans decreased in hyperosmotic culture. Addition of betaine, an osmoprotectant, to the hyperosmotic culture increased the proportion of highly sialylated and tetra-antennary N-linked glycans, while it increased the expression of the N-glycan branching/antennary genes. Taken together, the results obtained in this study provide a better understanding of the effects of hyperosmolality on N-glycosylation biosynthesis pathway in rCHO cells. Acidic Golgi pH plays an important role in protein glycosylation, one of the critical quality attributes of therapeutic proteins. To determine the intracellular Golgi pH during culture, stable CHO cell clones expressing pHluorin2, a ratiometric pH-sensitive fluorescent protein (FP), in the cis- and trans-Golgi, were constructed by fusing pHluorin2 with specific targeting proteins. Stable CHO cell clones expressing pHluorin2 in the cytoplasm were also constructed. The subcellular localization of FPs was confirmed by immunofluorescence analysis. Live-cell imaging revealed that the intracellular pH of clones expressing the ratiometric pH-sensitive FPs converged to a specific pH range (cis-Golgi: 6.4 – 6.5, trans-Golgi: 5.9 – 6.0, and cytoplasm: 7.1 – 7.2). The intracellular pH was successfully evaluated in various culture conditions. Although culture pH was maintained at 7.2 in a bioreactor, the Golgi pH increased with culture time. Elevated ammonia concentration and osmolality were partially responsible for the increased Golgi pH during bioreactor cultures. Taken together, the application of ratiometric pH-sensitive FPs in monitoring the Golgi pH of CHO cells during culture provides a new perspective to improve protein glycosylation through intracellular pH control.

Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 임상적 사용에 적합한 단백질 번역 후 변형 능력으로 인해 치료용 당단백질 생산에 가장 널리 사용되는 포유동물 숙주세포이다. 당쇄화는 치료용 당단백질의 효율, 생체활성, 용해도 및 생체내 안정성에 영향을 줄 수 있는 중요한 요소이며, 치료용 당단백질 생산 바이오프로세스 개발 시 주요 쟁점 중 하나는 높은 생산성을 얻는 동시에 좋은 품질을 유지하는 것이다. 따라서 치료용 단백질 생산 시 균일한 당쇄화 수준(당쇄화 이질성의 감소)을 달성하기 위해서는, 바이오프로세스 과정에서 당쇄화 생합성 경로에 대한 상세한 이해가 필요하다. 고삼투압 배양조건이 단백질의 당쇄화에 어떠한 영향을 미치는지 이해하기 위해 Fc 융합 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포를 대상으로 고삼투압 배지에서 배양하였다. 고삼투압 배양조건은 Fc 융합 단백질의 생산성을 증가시키지만, Fc 융합 단백질의 시알산 함량 비율을 감소시켰다. 52개의 N-당쇄화 관련 유전자 발현은 NanoString nCounter 시스템에 의해 평가되었고, 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 이용한 N-글리칸 분석결과, 2개, 3개, 4개 결합된 시알산 및 4개 안테나 구조 비율이 고삼투압 배양에서 감소함을 확인하였다. 삼투압 보호제인 베타인(betaine) 첨가는 N-글리칸의 시알산 및 안테나 구조를 회복시켰고 이는 N-글리칸 안테나 구조 관련 유전자 발현과 관련이 있다. 상기 연구를 통해 고삼투압 배양조건이 재조합 CHO 세포의 N-당쇄화 과정에 미치는 영향을 이해할 수 있다. 산성의 골지 pH는 치료용 단백질의 중요한 품질 특성 중 하나인 단백질의 당쇄화에 중요한 역할을 한다. 배양과정 중 세포 내 골지 및 세포질 pH 측정을 위해, 시스 및 트랜스 골지에 비율 pH 민감 형광단백질인 pHluorin2와 특정 표적 단백질들을 융합시켜 안정 CHO 세포 클론을 만들었다. 발현된 형광단백질의 세포 내 위치는 면역형광법으로 확인되었고, 생세포이미징 결과 세포내 pH가 특정범위(시스 골지: 6.4 – 6.5, 트랜스 골지: 5.9 – 6.0, 세포질: 7.1 – 7.2)로 수렴함을 확인했다. 다양한 배양조건에 따른 세포내 pH 변화를 측정하였고 pH 7.2로 유지되는 바이오리액터에서 골지 pH는 배양시간이 흐름에 따라 증가했다. 증가된 암모니아 농도와 삼투압이 골지 pH 증가와 연관될 수 있다. 따라서 pH 민감성 형광단백질을 이용한 CHO 세포내 골지 pH 모니터링 방법은 세포내 pH 조절을 통한 단백질 당쇄화 향상을 위한 새로운 관점을 제공한다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 19007
형태사항 iv, 82 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 이종현
지도교수의 영문표기 : Gyun Min Lee
지도교수의 한글표기 : 이균민
수록잡지명 : "Understanding of decreased sialylation of Fc-fusion protein in hyperosmotic recombinant Chinese hamster ovary cell culture. N-glycosylation gene expression and N-linked glycan antennary profile.". Biotechnology and bioengineering, v.114.no.8, pp1721-1732(2017)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 69-78
주제 Chinese hamster ovary (CHO) cells
Fc-fusion protein
nanostring nCounter system
N-glycosylation
cis-Golgi
trans-Golgi
ratiometric-pH sensitive fluorescence protein
culture conditions
chinese hamster ovary (CHO) 세포
Fc 융합 단백질
nanostring nCounter 시스템
N-당쇄화
시스 골지
트랜스 골지
비율 pH 민감 형광단백질
배양환경
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