Protein kinases are involved in numerous functions such as cell growth, migration, and metabolism. However, oncogenic kinases cause various cancers or diseases due to an expression of oncogene. The development of therapeutic agents for Bruton’s tyrosine kinase (Btk), which is the cause of B-cell lymphoma, was mainly focused on small-molecule inhibitors targeting the ATP-binding site. However, these inhibitors interact non-specifically with numerous proteins with homologous amino acids within ATP-binding sites, resulting in serious side effects. In addition, there is a great disadvantage that the drug efficacy is decreased by generating a drug resistance mutation. In this thesis, we investigated the function of allosteric regulatory domain of Btk and developed a specific repebody to demonstrate the inhibitory effect of Btk activity.
In Chapter 1, we investigated the development of repebody specific for allosteric regulatory domain of Btk. First, we constructed a docking model using a computationally-driven docking algorithm to identify the positive function of the allosteric regulatory domain, and identified key residues involved in regulating Btk activity. Based on the result, we have successfully developed a repebody with high affinity and specificity in the allosteric regulatory domain by phage display. The developed repebody effectively inhibited the Btk activity compared with ibrutinib, which is a small-molecule inhibitor for Btk, and proved to be effective in drug resistance mutations. In addition, repebody blocked the activity of downstream kinases of Btk in B cell lymphoma and inhibited cell growth. This demonstrates the possibility of a notable protein drug for the treatment of B cell lymphoma such as chronic lymphocytic leukemia (CLL).
In Chapter 2, we have successfully identified the inhibition mechanism of repebody for Btk, which was developed using computationally-driven binding interface prediction approach. In order to apply a new algorithm for predicting the binding interface of two proteins, we successfully demonstrated the prediction of the binding interface of repebody using IgG and IgG-specific repebody (RbF4) as model proteins. Based on this, we predicted the binding interface of the repebody specific for the allosteric regulatory domain of Btk and explained the inhibition mechanism of Btk activity.
In this thesis, we study that the allosteric regulatory domain has a possibility of a new drug target that can effectively modulate the activity of oncogenic kinases and develop a protein binder specific for the allosteric regulatory domain to prove the possibility as a candidate for a new therapeutic agent applicable to various oncogenic kinases.
인산화효소는 세포의 성장, 이동, 대사 등 다양한 기능에 관련된 단백질이다. 그러나 돌연변이 발현으로 인해 종양 유발 인산화효소로 변형되어 다양한 암 발생을 유발한다. 그 중 B세포림프종의 원인인 브루톤 티로신 키나아제의 치료제 개발은 주로 활성 부위인 아데노신3인산의 결합 부위를 표적 하는 저분자 화합물에 집중되었다. 하지만 상동의 아미노산을 갖는 수많은 단백질과 비 특이적으로 결합하여 심각한 부작용을 초래한다. 또한, 약물 저항성 돌연변이를 발생시켜 치료제의 효능이 상실되는 큰 단점이 있다. 따라서, 본 학위논문에서는 브루톤 티로신 키나아제의 알로스테릭 조절 도메인의 기능을 규명하고 이에 특이적인 리피바디를 개발하여 인산화효소의 활성 억제 효과를 입증하는 연구를 수행하였다.
1 장에서는 알로스테릭 조절 도메인에 특이적인 리피바디 개발에 관한 연구를 수행하였다. 먼저 알로스테릭 조절 도메인의 기능을 규명하기 위해 컴퓨터 기반 도킹 알고리즘을 이용하여 구조적 모델을 확립하고 활성 조절에 관여하는 중요한 아미노산을 밝혀냈다. 이후 파지 디스플레이 기법으로 알로스테릭 조절 도메인에 높은 결합력과 특이성을 갖는 리피바디를 성공적으로 개발하였다. 개발된 리피바디는 저분자 화합물인 ibrutinib에 비해 브루톤 티로신 키나아제의 활성을 효과적으로 저해하였으며, 약물 저항성 돌연변이에서도 효과적임을 증명하였다. 또한, 리피바디는 B세포림프종에서 브루톤 티로신 키나아제의 하위 단백질들의 활성을 차단하고 세포 성장을 억제하였다. 이로써 만성림프구성백혈병과 같은 B세포림프종 치료를 위한 새로운 단백질 치료제로서의 가능성을 입증하였다.
2 장에서는 컴퓨터 기반 결합 부위 예측 알고리즘을 이용하여 개발된 리피바디의 브루톤 티로신 키나아제 활성 억제 기작을 성공적으로 규명하였다. 두 단백질의 결합 부위를 예측하기 위한 새로운 알고리즘 개발을 위해 모델 단백질로 IgG와 IgG에 특이적인 리피바디를 사용하여 리피바디의 결합 부위 예측을 성공적으로 입증하였다. 이를 바탕으로 브루톤 티로신 키나아제의 알로스테릭 조절 도메인에 특이적인 리피바디의 결합 부위를 예측하였고, 인산화효소의 활성 억제 기작을 설명하였다.
위의 연구들을 통해, 종양 유발 인산화효소의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 약물 표적의 가능성을 제시하고 이에 특이적인 결합 단백질을 개발함으로써 다양한 종양 유발 인산화효소에도 적용 가능한 새로운 치료제 후보 물질로서의 가능성을 입증하였다.
