Over decades, many types of therapeutics for cancer have been developed, and they mostly targeted receptors on cell surface or kinases by chemical drugs with low specificities. However, there are numerous intracellular proteins that are connected in cellular signaling processes, and the proteins are fundamentally related with cellular functions such as cell proliferation. Based on this fact, signaling proteins have been targeted for therapeutic effects, but despite intense efforts in medical industry and academia, a therapeutic potential on intracellular signaling proteins has remained elusive due to the difficulty in efficient intracellular accessibility. In particular, proteins do not enter mammalian cells directly, which severely limits many disease-relevant targets. In this regard, we developed protein binders and delivered the binders for modulation of signaling pathways.
Bruton’s tyrosine kinase (Btk) is one of intracellular protein kinases, and it is an important regulator in B cell receptor (BCR) signaling pathway, in which plays a key role in processes such as cell proliferation. We previously developed a Btk-specific protein binder, rF10, which was designed to target the SH2 domain of human Btk (hBtk). We present an approach to deliver proteins to B-cell lymphoma in a highly efficient and versatile way. The hBtk-specific protein binder, rF10, was genetically fused with a cell-penetrating peptide and intracellularly delivered. We observed that the repebody effectively inhibits the activity of hBtk in B-cell lymphoma, leading a down-regulation of BCR-mediated signaling pathway, showing its potent strategy for therapeutic proteins.
We demonstrate the modulation of the ERK2-mediated signaling pathway through the cytosolic delivery of a native regulatory protein for ERK2, that is, PEA-15 and its engineered variants, PEA-16, using a bacterial toxin-based delivery system. Based on biochemical and structural analyses, a high-affinity variant for ERK2 was designed. Semi-rational approach led to about an 830-fold increase in the binding affinity of PEA-15, resulting in more effective modulation of the ERK2-mediated signaling. Also, we demonstrated the utility and potential of our approach by showing an efficient cytosolic delivery of PEA-16 and the effective suppression of cell proliferation through the inhibition of the ERK2 function.
We present the development of an anti-Bcl-2 protein binder as a potent anti-cancer agent and delivered for targeted cancer therapy. We developed anti-Bcl-2 repebody based on modular approach, and it was demonstrated that the repebody showed high specificity. Also, the repebody was applied to the EGFR-specific repebody and the bacterial toxin-based delivery system for high-efficiency targeted delivery, and the repebody showed effective inhibitory effects in cell proliferation, suggesting the general utility of the delivery approach in targeted cancer therapy.
In this study, we demonstrated the utility and potential of protein binders and intracellular delivery system for modulation of cellular signaling pathways. The present approach can be used broadly for modulating the cell signaling processes and understanding their roles in cellular function, as well as for the development of therapeutics.
암을 치료하기 위하여 여러 치료제들이 개발되어 왔는데, 이들의 대부분은 세포 표면에 노출되어있는 수용체를 표적하는 항체들이나 낮은 특이성으로 효소에 결합하는 화합물이다. 하지만 세포의 정상적인 기능을 위하여 세포 내에는 신호 전달 경로가 구성이 되어 있으며, 이 신호 전달 체계는 세포 증식과 같은 기능을 담당하는 만큼 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 이유로 비정상적인 신호 전달 체계는 세포의 과대 증식 등 정상적이지 않은 현상들을 일으키며 이는 암과 같은 악성 종양 관련 질병과 밀접한 관련이 되어 있다. 비정상적인 세포 신호 전달 경로를 조절하기 위해서는 특이성이 높은 단백질 치료제가 이용될 수 있지만 세포 내로의 접근이 어려운 것을 현재 치료제 개발의 가장 큰 문제점으로 꼽을 수 있다. 이에, 본 연구에서는 세포 내 신호 전달 물질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 개발하고 이를 세포 내로의 전달하여 세포 신호 전달 체계 조절에 대한 연구를 수행하였다.
제 1장에서는 브루톤티로신키나아제의 결합하는 리피바디를 악성 B 세포로 전달하는 것에 대한 연구에 관한 것이다. 브루톤티로신키나아제의 알로스테릭 조절 도메인에 특이적으로 결합하는 리피바디를 세포 투과 펩타이드를 이용하여 악성 B 세포로 쉽고 효율적으로 전달하여 B 세포 수용체 관련 세포 신호 전달 체계를 성공적으로 조절하고 세포 증식을 효과적으로 억제 하는 것을 확인함으로써 B 세포로써의 단백질 전달 전략을 확립하였다.
제 2장 에서는 세포 외 신호조절 인산화효소2의 음성 조절자인 PEA-15를 박테리아 독소 기반 단백질 전달 시스템을 통해 암 세포에 효율적으로 전달하였다. 또한 펩타이드 설계 기술을 이용하여 세포 외 신호조절 인산화효소2에 대해 높은 결합력을 지니는 새로운 단백질인 PEA-16을 합리적으로 개발하였으며, PEA-16에서 추가적으로 설계된 부분은 세포 외 신호조절 인산화효소2의 CD 도메인에 결합함을 컴퓨터 기반 시뮬레이션을 통해 확인하였다. 또한, 이를 같은 단백질 전달 시스템을 통해 암 세포에 효율적으로 전달함으로써 세포 외 신호조절 인산화효소2 관련 세포 신호 전달 체계를 효과적으로 억제할 수 있었으며, 세포 증식에서의 억제 효과도 확인함으로써 암 치료제로써의 가능성을 보였다.
제 3장에서는 암 세포 특이적인 표적 치료제로써의 폭 넓은 이용성 및 적용성을 확인하기 위하여 Bcl-2 단백질에 결합하는 결합 단백질을 새롭게 개발하였다. 인공 항체인 리피바디를 기반으로 하여 모듈 기반 설계 기술을 통해 Bcl-2 패밀리 단백질 중에서도 Bcl-2 에 높은 특이성을 보이고 표적 단백질인 Bcl-2에 대하여 높은 결합력을 지니는 리피바디를 확보하였다. 해당 리피바디를 박테리아 독소 기반 단백질 전달 시스템을 통해 암 세포 마커인 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 암 세포에 효율적으로 전달하였다. 그 결과, Bcl-2 단백질과 관련된 세포 신호 전달 체계를 효과적으로 억제함을 확인하였고 이를 통해 암 치료제로써의 넓은 적용성을 확인하였다.
위의 연구들을 통해 세포 신호 전달 체계를 조절할 수 있는 결합 단백질들을 개발하고 표적하고자 하는 세포 내로 효율적으로 전달하여 치료 효능을 검증하였다. 본 연구는 세포 신호 전달 체계에서 단백질들의 기능을 이해하고 치료제를 개발하는데 있어서 폭 넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
