Human APOBEC3G (A3G) is an innate immunity protein against human immunodeficient virus (HIV) by deaminating cytosine into uracil on reverse transcripted single-stranded DNA of HIV. Vif, a HIV protein that functions as a substrate receptor together with Elongin BC complex and CBF\beta, for the Cullin 5-based E3 ligase complex, leads to ubiquitination and subsequent proteosomal degradation of A3G. To date, the structural information of this A3G-Vif bound E3 ligase complex is limited, as the structure of full-length A3G is not revealed since its self-oligomerizing nature of A3G. Here, we report three dimensional reconsturction of the hexameric complex of full-length A3G and Vif–CBF\beta–Elongin B–Elongin C–Cullin5 by using negative staining electron microscopy and chemical crosslinking. YFP tagged on N-terminal domain of A3G revealed that A3G dimerizes through its N-terminal domain, also A3G and Vif–CBF\beta– ElonginB–ElonginC–Cullin5 is forming 2:1 complex. Chemical crosslinking of lysines, followed by mass spectrometry also provides an evidence of N-terminal dimerization of A3G, while having a novel hydrophobic interface consisted of helix α6 to helix α6’. Full-model construction of E3 ligase, A3G–Vif–CBF\beta–Elongin B–Elongin C–Cul5–Rbx1–UbcH5–ubiquitin, providing structural basis of Vif-mediated A3G ubiquitination mechanism.
인간 단백질 APOBEC3G (A3G) 는 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV) 의 사이토신을 유라실로 탈아민화 시킴으로써 단일 나선 DNA의 에 대한 선천적 면역을 형성해 주는 단백질이다. 그러나 HIV의 단백질인 Vif는 Elongin B, Elongin C, CBF\beta와 함께 Cullin-5의 기질 수용체가 되어 A3G에 유비퀴틴을 붙임으로써 분해시켜버린다. 현재까지는 A3G의 올리고머 형성으로 인해 A3G-Vif 컴플렉스의 구조적 정보가 극히 제한적이었다. 우리는 음성 염색법을 통한 전자현미경 이미징과 화학적 교차결합을 통해 A3G와 Vif–CBF\beta–Elongin B–Elongin C–Cullin5 컴플렉스의 3차원적 구조를 재구축하였다. 형광단백질이 부착된 A3G를 통해 우리는 A3G가 N 말단을 통해 이량체를 형성하며, 이 이량체를 바탕으로 Vif와 결합한다는 것을 밝혀내었다. 라이신을 통한 화학적 교차결합과 질량 분석을 통해 A3G의 N 말단 이량체 형성에 소수성 상호작용이 중요하다는 것을 보았다. 이를 통해 A3G–Vif–CBF\beta–Elongin B–Elongin C–Cul5–Rbx1–UbcH5–ubiquitin으로 이루어진 E3 리가아제 전체의 컴플렉스 모델을 만들 수 있었고, Vif가 관여된 A3G의 분해 메커니즘을 제시하였다.
