Investigation of the structure of the protein molecule is essential for understanding the function of the protein. A numerous number of studies have been conducted so far to reveal three-dimensional structures of various proteins. However, studies on the conformational distribution of the protein molecule that can possess have not been extensively issued due to the lack of experimental methods. Recently, a class of proteins that function in unstructured states, called Intrinsically Disordered Protein (IDP), as well as proteins with compact structures play important roles in various biological processes. The qunatitative conformational distribution of unstructured protein molecules is meaningful information for understanding biological processes involving these proteins. However, the inherent flexible structures of these proteins make it difficult to experimentally determine the conformational distribution. Here, we present a method named “Single-Object Cryo-EM Sampling (SOCS)” to study the conformational distribution by applying site specific nanogold labeling. Two nanogold particles were labeled at two desired target sites on cytochrome c and the distance between two particles was measured as a structural parameter via cryo-electron microscopy. The key is that the concept of single-object scattering sampling (SOSS) idea is applied here so that the distance information can be extracted from each single protein molecule. The contrast provided by the nanogold particles is strong enough to provide the distance between them although the protein itself is not visible due to the low contrast. A number of cryo-electron microscopy images of nanogold labeled cytochrome c for both folded and unfolded states were obtained to extract a statistical distribution of interparticle distance, which is associated with the shape of conformational distribution. While conventional cryo-electron microscopy provides opportunities to reconstruct the averaged three-dimensional structure of protein complexes with molecular weights higher than 100 kDa, the experimental concept used in this study can detect various conformations of the protein including rarely-populated structures even for small or disordered proteins. Data processing procedures and analysis scheme on statistical distribution were also developed and discussed. This experimental concept is expected to have a potential applicability to study the conformational distribution of objects with flexibly varying structures and their participating reactions at a single molecule level.
단백질 분자의 구조에 대한 정보는 그 분자의 역할을 규명하는데 필수적인 요소이다. 그동안의 많은 연구들을 통해 다양한 단백질 분자의 3차원 구조들이 밝혀졌다. 그러나 이러한 연구는 대부분 하나의 안정된 평균 구조를 구하는데 집중되어 있으며, 단일 단백질 분자가 가질 수 있는 다양한 구조적 변동의 범위를 측정하는 연구는 적합한 방법의 부재로 인해 많이 이루어져 있지 않다. 특히 최근 들어 IDP와 같이 특정한 3차원 구조를 가지지 않고 유연한 구조를 갖는 단백질들이 중요한 생체 반응에 관여함이 알려짐에 따라 단백질이 가질 수 있는 다양한 구조 분포를 통계적으로 시각화 할 수 있는 실험적 방법이 필요하다. 본 연구에서는 ‘단일 대상 저온 전자현미경 샘플링’이라는 실험적 방법을 제시하고 이를 이용하여 사이토크롬-씨 단백질의 접힘 및 풀림 상태에 대한 통계적 구조 분포를 측정하였다. 저온 전자 현미경을 이용하여 다수의 싸이토크롬-씨 단백질의 이미지를 얻은 다음 각 이미지로부터 구조적 인자를 추출하고 이를 이용하여 통계적 분석을 진행하였다. 싸이토크롬-씨와 같이 작은 분자량의 단백질은 직접적인 전자 현미경 이미지를 얻기 어려우므로 금 나노 입자를 분자상의 원하는 곳에 표지하여 구조 탐색인자로써 사용하였다. 서로 다른 두 위치에 나노 입자를 표지하고 이에 대한 전자 현미경 이미지를 얻은 후 두 입자간 거리를 구하여 이 거리 값을 해당 단백질 분자의 특징적인 구조 인자로 삼아 단백질의 구조 분포를 도출하였다. 우선 구조를 이미 알고 있는 접힘 상태의 분자에 대해 실험을 진행하여 ‘단일 대상 저온 전자현미경 샘플링’방법의 타당성을 확인하고 풀린 상태의 분자에 대한 구조 분포를 실험적으로 측정하고 시각화 하였다. 전자현미경 이미지 처리와 통계적 데이터 분석 방법 또한 확립하였다. 본 연구에서 제시한 실험적 방법이 다양한 비정형 단백질 분자의 구조 분포에 대한 정보를 얻는데 기여하기를 기대한다.
