A successful targeted therapy, trastuzumab is treated to breast cancer patients who are diagnosed as HER2 positive which means HER2 gene-amplification, HER2 overexpression or both. Here, we applied single-molecule pull-down, immunolabeling, and co-IP to HER2 and HER3 signaling within breast cancer cell lines. We observed highly heterogeneous signaling phenotypes of them while their drug responses were also heterogeneous. Finally, we found that HER3-$p85 \alpha$ PPI was highly correlated to trastuzumab efficacy while HER2-related signaling phenotypes showed low correlation.
Ligand induced heterodimer between the orphan ligand human epidermal growth factor receptor (HER2/ErbB2) and its catalytically impaired homolog HER3 is known to the most proliferative among all the dimers formed within HER family. Moreover, the heterodimer is well known for rescuing many cancer from respective targeted therapy. The superiority of HER2-HER3 heterodimer have not been explained through in vitro kinase assay even using vesicle anchored kinase assay. Using single-molecule pull-down and co-immunoprecipitation (co-IP), we specifically pulled down intact HER2 homo- or HER2-HER3 heterodimer which are formed on cell membrane on glass surface and observed their properties. By virtue of the mild detergent digitonin, the dimers maintain their kinase activity after they are extracted from cell. When ATP and magnesium are introduced, the dimers phosphorylates their tyrosine sites. By introducing eGFP labeled downstream proteins (grb2, $PLC \gamma$, and $p85 \alpha$), we found that known grb2 binding site of phosphorylated HER2 (pY1139) did not directly recruit grb2. Instead, grb2 recruitment was increased when a famous scaffold of HER2, SHC1, and its known tyrosine kinase, Src were introduced during phosphorylation step. We also measured enzymatic properties of intact HER2 dimers extracted from SKBR3. Although both dimer equally use HER2 kinase as an effective enzyme, HER2-HER3 heterodimer shows about 150 times faster maximum catalytic rate for single phosphorylation site than HER2 homodimer while their Michaelis constants for ATP are similar. HER2-HER3 heterodimer also endures HER2 Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI), Lapatinib with ATP and magnesium while HER2 homodimer is effectively inhibited.
ed. However, when HER2-HER3 heterodimer treated with Lapatinib without ATP and magnesium, it loses the resistance. Moreover, when we added PTPN1 during Lapatinib inhibition, we observed that the endurance of the heterodimer against lapatinib severally impaired. From these results, we suggest that the resistance is based on the overwhelming catalytic rate of HER2-HER3 heterodimer.
성공적인 표적 치료법인 trastuzumab은 HER2 유전자 증폭 또는 HER2 과발현이 발견된 유방암 환자에게 처방된다. 본 연구의 전반부는 유방암 세포주 내에서 HER2 및 HER3 신호 전달체계에 단일 분자 면역침강, 면역 표지 및 공동 면역침강법을 적용했다. HER2를 과발현한 유방암 세포주마다 약물에 대한 반응이 다른 것만큼, 신호 전달 표현형 또한 제각각임을 관찰했다. 끝으로, HER2와 관련된 신호전달 표현형들은 모두 트라스투주맙에 대한 반응성과 낮은 상관 관계를 보인 반면 HER3-$p85 \alpha$ PPI는 높은 상관 관계가 있음을 발견했다.
리간드가 없는 HER2와 이의 촉매 기능이 손상된 동족체인 HER3는 리간드 유도에 의해 이종 이합체를 만든다. 이 이종 이합체는 HER 단백질 족 내에 형성된 모든 이합체 중에서 가장 세포증식 효과가 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 이종 이합체는 여러 종류의 암에서 표적 치료에 대한 저항기작으로 유명하다. HER2-HER3의 이종 이합체의 우수성은 소수포 부착형 인산화 실험을 통해 잘 설명되지 못했다. 우리는 단일 분자 면역침강 및 공동 면역 침강법을 사용하여 세포막에서 형성된 이합체들을 추출하여 그들의 효소적 특성을 관찰했다. 약한 계면활성제인 digitonin을 이용해, 추출된 이합체의 효소 활성을 유지할 수 있었다. 이를 이용, 아데노신 삼인산 (ATP)과 마그네슘을 처리했을 때, 분리된 이합체가 타이로신 부위를 인산화시키는 것을 관찰했다. 또한, 우리는 eGFP가 표지 된 하부 신호전달 단백질 (grb2, PLC$\gamma$ 및 p85$\alpha$)을 도입함으로써, 인산화 된 HER2 (pY1139)의 알려진 grb2 결합 부위가 grb2 를 끌어들이지 않음을 발견했다. 그 대신, 유력한 HER2의 스캐폴드 단백질인 SHC1 과 이를 인산화하는 것으로 알려진 Src가 함께 처리되었을 때 grb2 가 HER2에 결합했다. 또한, 유방암 세포주인 SKBR3에서 추출한 HER2 이합체들의 효소 특성을 측정했다. HER2-HER3 이종 이합체와 HER2 동종 이합체는 실질적 효소로서 HER2 인산화효소를 동일하게 사용하지만 HER2 호모 다이머보다 단일 인산화 부위에 대해 최대 촉매 속도가 약 150 배 더 빠른 것을 확인할 수 있었다. 반면, ATP에 대한 미카엘리스-멘튼 상수는 유사했다. 또한, HER2-HER3 이종 이합체는 ATP와 마그네슘이 있을 때, HER2 타이로신 인산화효소 억제제인 (TKI) 라파티닙에 대한 저항성을 보인 반면, HER2 동종 이합체는 효과적으로 억제 됨을 확인했다. 그러나 HER2-HER3 이종 이합체가 ATP와 마그네슘이 없이 라파티닙에 노출되면, 저항성을 잃어 버리는 것을 확인했다. 끝으로, PTPN1을 첨가해 인산화 속도를 줄였을 때, 라파티닙에 대한 HER2-HER3이종이합체의 저항성이 심각하게 손상됨을 관찰했다. 이러한 결과로부터 라파티닙에 대한 저항성은 HER2-HER3 이종 이합체의 압도적인 촉매 속도에 근거한다고 주장한다.
