rhBMP-4 has a potential for therapeutic uses for bone and cartilage repair, and treatment of osteoarthritis and rheumatoid arthritis through its ability to stimulate chondrogenesis. For clinical applications, obtaining large quantities of biologically active rhBMP-4 is essential. rhBMPs used in clinical applications are produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. rhBMP-4 is synthesized as large precursors, which then undergo proteolytic cleavage within the secretory pathway by proprotein convertases (PCs) to produce functionally active mature dimers. To improve product yield, several strategies such as PC overexpression and optimization of the cell culture environment have been attempted with limited success.
For large scale production of rhBMP-4, a recombinant CHO cell line stably expressing hBMP-4 was established by dhfr/methotrexate (MTX)-mediated gene amplification. The rhBMP-4 concentration reached a maximum at 4 µg/mL on day 3-5, and then decreased along the cell viability until the end of culture. Incubation of the supernatants obtained in mid-exponential phase (day 4) with cells obtained in death phase (day 6) indicated that a combination of the action of proteases and glycosidases released from the dead cells could be responsible for decrease of rhBMP-4 concentration at the end of cultures. To maximize the production of rhBMP-4 from CHO cells, the effects of culture temperature and pH on cell growth and BMP-4 production were investigated. Cells were cultivated in a 2L-bioreactor at different culture temperatures (33 and 37℃) and pH (6.7, 6.9, 7.2, and 7.5). Lowering the culture temperature arrested cell growth and increases the specific productivity (qrhBMP-4). The highest rhBMP-4 concentration (4.6 ± 0.5 μg/mL) was obtained at pH 7.2 and 37 °C. The extent of decrease of rhBMP-4 concentration was alleviated as maintaining high cell viability for a longer culture period at the lower culture temperature. Regardless of culture temperature and pH, significant rhBMP-4 degradation via increased proteolytic activity was observed in the decline growth phase. Protease inhibitors such as EDTA and leupeptin were toxic and thus did not enhance rhBMP-4 production. High viability was achieved in repeated batch cultures with frequent medium exchanges. These cultures showed enhanced rhBMP-4 productivity, demonstrating the potential of repeated batch cultures as a means for improved rhBMP-4 production.
Endocytic regulation serves a critical role in modulating the extracellular level of signaling molecules including BMPs. Unfortunately, endocytosis may result in poor yields of rhBMP-4 from CHO cell cultures. When rhBMP-4 was incubated with CHO cells, rhBMP-4 was actively internalized into cells. Cell surface bound-heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) served as the major receptors for rhBMP-4 internalization. Removal of cell surface heparan sulfate (HS) by heparinases or reduction of HSPG synthesis by knockdown of xylosyltransferase2 (xylt2) in CHO cells decreased internalization of rhBMP-4. In addition, treatment with endocytosis inhibitors (chlorpromazine, genistein, and dynasore) identified a clathrin- and dynamin-dependent endocytic pathway as the major route for rhBMP-4 internalization. To enhance product yield by minimizing rhBMP-4 internalization in recombinant CHO (rCHO) cell cultures, we have tested various strategies to reduce HSPG synthesis (knockdown of xylt2 and sodium chlorate treatment) or inhibit the binding of rhBMP-4 to cell surface-bound HSPGs (supplementation with heparin or dextran sulfate (DS)). Among these approaches, DS, which is a linear anionic sulfated polysaccharide with similarity to HS chains, was the most effective in enhancing rhBMP-4 production in rCHO cell cultures. Compared with the control cultures, DS addition to culture medium (1.0 g/L) resulted in 1.4-fold and 2.3-fold increases in maximum rhBMP-4 concentration in batch and fed-batch cultures, respectively. Thus, rhBMP-4 in culture medium is internalized into CHO cells through cell surface-bound HSPGs and the addition of DS to the culture medium significantly increased rhBMP-4 production by blocking the internalization of rhBMP-4 into rCHO cells.
As CHO DG44 host cells express the essential elements of BMP signaling pathways, a CHO cell line expressing rhBMP-4 is capable of autocrine BMP signaling and hence having the unexpected cellular functions affected by rhBMP-4 mediated signaling pathways. The previous works in other cell lines suggest that the negatively impacted cell growth and the auto-downregulation of BMP-4 gene including the post-transcriptional regulation on BMP-4 mRNA and it could contribute to the low rhBMP-4 productivity in CHO cells. In this study, we observed that treatment of a selective inhibitor of the BMP type I receptors, LDN-193189, increased hBMP-4 mRNA expression and rhBMP-4 production. To clarify the effect of rhBMP-4, we investigated the inhibitory effects on cell culture profiles and the global changes of protein expression regarding cell growth and apoptosis upon rhBMP-4 treatment in CHO DG44 host cells. Using CRISPR/Cas9 gene-editing technologies, we knocked out BMPRII or BMPRIA gene in CHO DG44 cells to prevent the BMP-induced signaling. Using three different KO host cell lines (BMPRIA-KO-47, BMPRII-KO-20, BMPRII-KO-118) and a DG44 wild-type (wt) cell line, rCHO cell clones producing hBMP-4 were generated by a stepwise selection with increasing methotrexate (MTX) concentrations. The BMP-unresponsive BMPR KO host-derived cell lines resulted in increased hBMP-4 mRNA expression levels and improved productivity compared to the wild-type (wt) cell lines. The top high producing KO-derived and wt-derived clones were selected and evaluated with respect to the hBMP-4 mRNA levels and the rhBMP-4 productivities during the batch cultures. Using the knockout host cells, we generated hBMP-4 producing CHO cells free from autocrine BMP signaling and achieved the highest rhBMP-4 productivity (35.0 ± 0.9 μg/mL).
재조합 인간 유래 골 형성 촉진 단백질 4 (rhBMP-4)는 뼈와 연골 형성을 조절하는 능력을 통해 손상된 뼈와 연골 복원 및 관절염 치료를 위한 의약품으로써의 잠재력을 가지고 있다. 고령화 및 비만인구 증가에 따른 척추 및 골절 환자의 증가로 인해 앞으로 골이식 관련 시장이 성장할 전망으로 비용 효과적인 rhBMP-4 생산을 위한 대용량 배양 공정 개발이 필요하다. rhBMP-4는 번역 후 변형, 분비 과정에 효율적인 플랫폼을 제공하는 포유동물 유래 세포인 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 주로 생산되며, 큰 전구체로 합성되어 생물학적 활성을 띄는 이량체로 성숙하기 위해 분비 경로 내에서 단백질 전환 효소 (Proprotein Converters, PC)에 의해 단백질 가수분해 절단이 요구된다. 그럼에도 불구하고, CHO 세포에서의 rhBMP-4 생산은 낮은 생산성을 가진다. CHO 세포에서 rhBMP-4 생산을 제한하는 원인을 이해하기 위하여 CHO 세포에서의 rhBMP-4 생산에 대한 광범위한 연구를 수행하였다.
CHO 세포로부터 rhBMP-4의 생산을 최대화하기 위해 배양 온도 및 pH가 세포 성장 및 rhBMP-4 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 2L 생물 반응기에서 서로 다른 배양 온도 (33 및 37 ℃)와 pH (6.7, 6.9, 7.2 및 7.5)에서 배양하였다. 배양 온도를 낮추면 세포 성장이 멈추고 비 생산성 (qrhBMP-4)이 증가하였다. pH 7.2와 37 ℃에서 가장 높은 rhBMP-4 농도 (4.6 ± 0.5 μg / mL)를 얻었다. 배양 온도와 pH에 관계없이, 재조합 CHO 세포주에서의 rhBMP-4 농도는 배양 중기에서 최대에 도달 한 다음 배양이 끝날 때까지 세포 생존율에 따라 감소했다. 각기 다른 배양 시기의 상등액만을 배양한 결과, 죽은 세포로부터 방출 된 단백질 분해 효소의 작용이 rhBMP-4의 농도를 감소시키는 원인이 된다고 할 수 있다. 다양한 단백질 분해 효소 억제제 중 EDTA, leupeptin 및 aprotinin이 rhBMP-4의 감소를 완화시켰다. 마지막으로 반복 회분식 배양 방식의 적용으로 빈번한 배지 교환을 통해 향상된 rhBMP-4 생산력을 보여 주었다.
세포 내 섭취를 통한 조절은 BMP를 포함한 신호 분자의 세포 외 수준을 조절하는데 결정적인 역할을 하며, CHO 세포에서의 rhBMP-4의 수율이 낮은 원인이 될 수 있다. rhBMP-4를 CHO 세포와 함께 배양했을 때 세포 내로 활발히 흡수되었다. 세포 표면의 헤파란 설페이트 프로테오글라이칸(HSPG)은 rhBMP-4 세포 내 섭취의 주요 매개체 역할을 했다. CHO 세포에서 헤파린 분해 효소에 의한 세포 표면 헤파란 설페이트(HS)의 제거 또는 xylosyltransferase2 (xylt2) 유전자의 기능 제거에 의한 HSPG 합성의 감소는 rhBMP-4의 흡수를 감소시켰다. 또한, 세포 내 섭취 저해제 적용을 통해 rhBMP-4의 흡수를 위한 주요 경로로써 clathrin- 및 dynamin- 의존성 경로임을 확인했다. xylt2 넉다운 및 염소산 나트륨 처리를 통해 HSPG의 합성을 줄이거나 헤파린 또는 덱스트란 설페이트 (DS) 첨가로 결합을 저해시켜 재조합 CHO 세포에서 rhBMP-4의 흡수를 최소화하고 생산성을 향상시켰다. 이러한 접근법 중, HS 사슬과 유사한 선형 음이온 설페이트화 된 다당류인 DS의 첨가가 가장 효과적이었으며, 회분식 배양에서의 1.4배 및 유가식 배양에서의 2.3배 rhBMP-4 생산성 증가를 얻었다.
CHO DG44 숙주 세포가 BMP 신호 전달 경로의 필수 요소를 발현하기 때문에, rhBMP-4를 발현하는 CHO 세포주는 BMP 신호를 자가 분비할 수 있으므로 rhBMP-4 신호 전달 경로에 의해 영향을 받는다. rhBMP-4를 발현하는 CHO 세포주 배양에서 BMP 1형 수용체의 선택적 억제제 (LDN-193189)의 처리가 hBMP-4 mRNA 발현과 rhBMP-4 생산을 증가시킨다는 것을 관찰했다. rhBMP-4의 영향을 명확히 하기 위해 CHO DG44 숙주 세포에서 rhBMP-4 처리 시 세포 성장 억제 및 전반적인 유전자 발현의 변화를 조사 하였다. CRISPR / Cas9 유전자 편집 기술을 사용하여 BMP 신호를 막기 위해 CHO DG44 세포에서 BMPRII 또는 BMPRIA 유전자를 제거하였다. 3개의 상이한 knockout (KO) 숙주 세포주 (BMPRIA-KO-47, BMPRII-KO-20, BMPRII-KO-118) 및 DG44 wild-type (wt) 세포주를 기반으로, dhfr/MTX 증폭 시스템을 통해 rhBMP-4를 생산하는 CHO 세포 클론을 제작하였다. BMPR KO 숙주 유래 세포주는 wt 유래 세포주에 비해 증가된 hBMP-4 mRNA 발현과 향상된 생산성을 보였다. BMPR KO 숙주 세포를 사용하여 BMP 신호 반응성이 없는 CHO 세포를 만들었으며 가장 높은 rhBMP-4 생산성 (35.0 ± 0.9 μg / mL)을 달성하였다.
