Chinese hamster ovary (CHO) cells activate and undergo apoptosis and autophagy for various environmental stresses. Unlike apoptosis, which has been widely studied in CHO cell cultures, studied on increasing the production of therapeutic proteins in CHO cells by targeting the autophagy pathway are limited. Autophagy is a global catabolic process which involves multiple pathways and genes that regulate the lysosomal degradation of intracellular components. Therefore, a detailed understanding of the autophagic pathway is necessary to enhance the production of therapeutic proteins by targeting autophagy.
In order to identify the effects of chemical autophagy inhibitors on the specific productivity ($q_p$ ), 9 chemical inhibitors that had been reported to target different phases of autophagy were used to treat 3 recombinant CHO (rCHO) cell lines. However, 3-MA was the only chemical that increased the $q_p$ in all of the cell lines tested. When autophagy-inhibiting activity of 3-MA on rCHO cell lines was evaluated, the addition of 3-MA exhibited an increased autophagic flux instead of an inhibition of autophagy. Taken all together, the positive effect of 3-MA on the $q_p$ was from the autophagic induction rather than inhibition and/or from some unknown mechnism.
To evaluate the effect of 3-MA on transcriptome dynamics in rCHO cells, RNA-seq was performed. By analyzing genes that were differentially expressed following the addition of 3-MA during culture, the role of 3-MA in the biological processes of rCHO cells was identified. One pathway markedly influenced by the addition of 3-MA was the unfolded protein response (UPR). Having a close relationship with autophagy, the UPR reestablishes protein folding homeostasis under ER stress. Taken together, transcriptome analysis improved the understanding of the role of 3-MA in gene expression dynamics in rCHO cells and its mechnism in enhancing the $q_p$.
바이오 의약품 시장에서 치료용 단백질 생산을 위해 가장 많이 쓰이고 있는 세포주는 Chinese hamster ovary(CHO)세포이다. CHO세포는 배양 중에 영양소 결핍이나 노폐물 축적으로 인한 환경적인 스트레스에 노출된다. 이는 세포예정사인 apoptosis와 autophagy를 유발하게 되는데, 세포사멸이 일어나게 되면 단백질 의약품 생산기간이 짧아지고, 세포가 분해되면서 나온 protease등이 생산성 및 품질에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 따라서 세포사멸에 대한 연구는 필수적으로 진행되어야 하는데, CHO세포에서 apoptosis에 관한 연구는 많이 진행되어 있는 반면, 자식작용(autophagy)이 CHO세포의 단백질 의약품 생산성에 미치는 연구는 많이 진행되어있지 않은 상태이다.
본 연구의 첫번째 부분에서는 Autophagy가 CHO세포의 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. 일반적으로 알려져 있는 9가지의 다른 autophagy 억제물질을 배양 중 첨가하여, autophagy 억제가 CHO 세포의 생존도, 생산성, 최대 생산량에 미치는 영향을 분석하였다. 사용된 autophagy억제 물질 중 autophagosome 형성을 방해하는 물질인 3-MA만이 실험에 사용된 3종류의 CHO 세포주 모두에서 생산성을 높이는 결과를 보여주었다. 하지만 3-MA가 첨가된 세포주들의 autophagy 발현도를 측정해본 결과 3-MA는 알려져 있는 메카니즘과 달리 autophagy를 유도하는 결과를 보여주었다. 때문에 3-MA로 인한 생산성 향상이 autophagy가 유도된 결과인지 혹은 다른 확인되지 않은 작용을 통한 것인지에 대한 조사가 필요했다.
두번째 부분에서는 3-MA로 인해 세포 내의 전체적인 유전자 조절이 어떻게 바뀌었는지 분석하기 위해 RNA-seq을 이용한 유전체 분석을 진행하였다. 어떠한 유전자들이 과발현 또는 저발현 (differentially expressed genes, DEG) 되었는지 조사하고, DEG들의 상관관계와 어느 biological pathway에 영향을 미쳤는지 분석하였으며 그 결과 unfolded protein response(UPR)에 관련되어 있는 유전자들이 다수 발견되었다. UPR은 autophagy와도 밀접한 연관이 있는 생물학적 경로로, 잘못 접힌 단백질로 인한 ER스트레스에 반응하여 세포의 단백질 접힘을 올바르게 회복시키는 작용이다. 이 과정에 중요한 작업을 담당하는 Atf4, Ddit3,Creb313와 같은 유전자들의 과발현이 관찰되었으며 이들의 downstream 타겟들도 발현이 향상된 것을 관찰하였다. UPR 외에도 autophagy 관련 유전자와 여러 transcription factor들의 과발현도 관찰이 되었다. 이 유전체 분석결과는 3-MA로 인한 CHO세포의 transcriptome dynamics를 이해하는 바탕을 제시한다.
