Post-translational control is a crucial mechanism for circadian timekeeping. Evolutionarily conserved kinases and phosphatases have been implicated in circadian phosphorylation and degradation of clock-relevant proteins, which sustain high-amplitude rhythms with 24 hr periodicity in animal behaviors and physiology. Here, we report a novel clock function of the heterodimeric $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent phosphatase calcineurin and its regulator sarah (sra) in Drosophila. Genomic deletion of the sra locus dampened circadian locomotor activity rhythms in free-running constant dark after entrainment in light–dark cycles. Poor rhythms in sra mutant behaviors were accompanied by lower expression of two oscillating clock proteins, PERIOD(PER) and TIMELESS(TIM), at the post-transcriptional level. RNA interference–mediated sra depletion in circadian pacemaker neurons was sufficient to phenocopy loss-of-function mutation in sra. On the other hand, a constitutively active form of the catalytic calcineurin subunit, Pp2B-$14D^{ACT}$, shortened circadian periodicity in locomotor behaviors and phase-advanced PER and TIM rhythms when overexpressed in
clock neurons. Heterozygous sra deletion induced behavioral arrhythmicity in Pp2B-$14D^{ACT}$ flies, whereas sra overexpression rescued short periods in these animals. Finally, pharmacological inhibition of calcineurin in either wild-type flies or clock-less S2 cells decreased the levels of PER and TIM, likely by facilitating their proteasomal degradation. Taken together, these data suggest that sra negatively regulates calcineurin by cell-autonomously titrating calcineurin-dependent stabilization of PER and TIM proteins, thereby sustaining high-amplitude behavioral rhythms in Drosophila.
지구상에 존재하는 모든 생물체가 갖고 있는 내부적인 생체시계는 낮과 밤의 변화를 인지하고 그에 따른 외부 환경이나 기후의 변화에 유동적으로 적응할 수 있도록 진화 되어왔다. 단순히 낮과 밤의 변화에만 국한된 것이 아니고 이러한 일주기성 리듬에 대한 정보가 축적되어 계절과 일년주기의 생활패턴에 대한 정보를 습득할 수 있고, 이는 유기체로 하여금 포식자로부터의 회피, 먹이의 효율적 습득 및 종족번식에 있어서 지대한 영향을 준다고 할 수 있다. 그 중에서도 우리는 사람과 동일한 주행성 리듬을 가지고 있는 초파리를 모델동물로 하여 생체리듬에 대하여 연구를 진행하였다. 그 결과 Sarah (Sra)라고 하는 유전자가 생체리듬의 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하고 있음을 확인할 수 있었다. sra라는 유전자의 발현을 생체리듬을 조절하는 특별한 조직내에서의 저해함으로서 이 유전자가 생체리듬에 어떤 영향을 미치는지 살펴보았고, 유의미한 결과값들을 도출해냈다. sra가 저해된 초파리는 정상적인 생체리듬을 유지할 수 없었고, 과발현시에는 하루 24시간의 주기를 26시간까지 늘리는 역할을 하는 것을 확인하였다. sra가 저해된 초파리의 뇌에서는 생체리듬을 조절하는데 중요한 단백질인 PERIOD 와 TIMLESS 등의 단백질의 발현양이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다. 이런 모습들을 초파리 뇌의 전체에서 일어나는 것이 아닌 특정 위치에 국한되어 발현양이 저해됨을 확인하였고, 이 특정위치에서 PDF와 같은 생체리즘을 조절하는데 중요한 인자들이 발현되고 있는 것으로 미루어 볼 때, sra와 생체리듬간의 독특한 상관 관계가 있음을 확인할 수 있었다. Cn subunit KO 초파리들을 통해 어떤 특정 subunit이 생체리듬을 조절하는데 중요한 요소인지를 확인할 수 있었고, 그중에서도 가장 영향력이 있었던 Pp2B-14D 유전자와 sra 유전자간의 상관관계를 살펴보았을 때 $sra^{KO}$/+ 초파리와 Pp2B-$14D^{ACT}$가 과발현된 초파리에서 생체리듬이 망가짐을 확인할 수 있었고 이는 $sra^{KO}$에서 보이는 모습과 동일한 양상을 띄었다. 이를 토대로 두 유전자간의 genetic interaction에 대해 살펴보고 이들의 타겟유전자가 PER 와 TIM이라는 것까지 새롭게 밝혀낼 수 있었다.
