Very recently, we have developed a β-hairpin scaffold based high affinity peptide ligand, termed ‘aptide’, presenting a comparable affinity and specificity to antibodies. Encouraged by it smaller size (3 kDa), stability, easy of genetic fusion, low immunogenic property, and specially less patent competition, aptide based potential applications can cover broad range of biomedical application, from applied research to therapeutics. This thesis has demonstrated that the application of aptide-based fusion proteins to targeted cancer therapy and the development of new antibody purification methods can broaden and enhance the applicability of aptide.
In chapter II, I described the fusion protein of TNFαand EDB-specific aptide for targeted cancer therapy. Although tumor necrosis factor (TNF)-α has shown potent antitumor effects, severe side effects at less than therapeutic doses have limited its systemic administration. As a new strategy for targeted delivery of TNF to tumors, I designed a fusion protein (mTNFα-$APT_{EDB}$) consisting of mouse TNFα and an aptide specific to extra domain B of fibronectin (EDB). mTNFα-$APT_{EDB}$ presented high selectivity and affinity (~6 nM) against EDB. When tested against the EDB-positive, TNFα-sensitive mouse fibrosarcoma cell line, WEHI-164, mTNFα-$APT_{EDB}$ exhibited a modest four-fold decrease in anticancer activity compared with unconjugated mTNFα. However, in EDB-overexpressing fibrosarcoma-bearing mice, systemically delivered mTNFα-$APT_{EDB}$ showed more uptake in tumor tissue and much greater tumor growth inhibition than mTNFα alone without substantial body weight loss. Moreover, the in vivo antitumor efficacy of mTNFα-$APT_{EDB}$ was further significantly enhanced by combination treatment with the chemotherapeutic drug, melphalan, suggesting that TNFα-mediated enhanced vascular permeability increase drug uptake in tumor and produce a synergistic effect. Taken together, these results demonstrate that a fusion protein of mTNFα with a cancer-targeting aptide could be a new anticancer therapeutic option for ensuring potent antitumor efficacy with low toxicity after systemic administration.
In chapter III, I described $Ca^{2+}$ ion induced affinity precipitation using a calsequestrin (CSQ) and Z-domain fusion proteins for antibody purification. In addition, the screening and identification of human Fc fragment (hFc)-specific aptide ($APT_{hFc}$) was studied for the construction of CSQ-$APT_{hFc}$ fusion protein. Affinity precipitation is an alternative strategy to conventional chromatographic methods for therapeutic antibody purification due to operational benefits of stimuli sensitive precipitation. CSQ is the calcium binding protein and its polymerization by $Ca^{2+}$ ion induce insoluble precipitation. In this study, the features of CSQ fused Z-domain (ZCSQ) for antibody purification were characterized. With 5 mM $Ca^{2+}$ ion concentration, ZCSQ efficiently precipitated the ZCSQ/IgG complex followed by released IgG with high purity in acidic buffer (pH 3.5 sodium citrate) and ensured at least 4 times regeneration by EDTA chelation of $Ca^{2+}$ ion. In CHO cell culture media, ZCSQ fusion protein clearly purify IgG and effectively removed host cell DNA contamination than protein A chromatography. Notably, the $Ca^{2+}$ ion induced ZCSQ/IgG precipitation neither affect the antigen binding ability nor cause the critical aggregation of the purified IgG. At the same time, I confirmed that $APT_{hFc}$ specifically bind to hFc protein with ~72 nM affinity and expected that $APT_{hFc}$ be a potential candidate for next-generation non-immunogenic affinity ligand of CSQ fusion protein for antibody purification. Taken together, these results demonstrate that $Ca^{2+}$ ion and CSQ based affinity precipitation is a proof of concept method for antibody purification
최근 본 연구실에서는 항체와 비슷한 수준의 친화성과 특이성을 갖은 베타 헤어핀 구조 기반의 펩타이드 리간드인 ‘앱타이드’ 를 개발하였다. 앱타이드의 작은 크기, 안정성, 융합의 용이성, 상대적으로 낮은 면역원성, 그리고 항체 시장의 특허 경쟁에서 자유로울 수 있다는 점은 이를 활용한 다양한 응용연구 및 치료제 개발에 이르기까지 앱타이드를 기반으로 하는 광범위한 의생명학적 연구분야에 적용 가능한 특징이 될 수 있다. 본 학위논문에서는 앱타이드 기반의 융합단백질을 이용한 암 표적 치료제와 새로운 항체 정제 방법 개발에 대한 연구를 통해 앱타이드의 잠재적인 응용가능성을 넓히고 강화 시킬 수 있음을 증명하였다.
2 장에서는, 암표적 치료를 위한 TNFα와 EDB 특이적 앱타이드의 융합 단백질에 대하여 기술하였다. 종양 괴사 인자 (TNF)-α는 강력한 항 종양 효과를 나타내지만, 심각한 부작용으로 인해 전신 투여가 제한적이다. 따라서, TNFα를 암 특이적으로 전달하기위한 새로운 전략으로 마우스 TNFα와 암특이적 마커인 EDB에 특이적인 앱타이드로 구성된 융합 단백질 (mTNFα-$APT_{EDB}$)을 설계하였다. mTNFα-$APT_{EDB}$는 EDB에 대해 높은 선택성 및 친화성 (~ 6nM)을 나타냈다. EDB과발현 및TNFα민감성 마우스 섬유 육종 세포주(mouse fibrosarcoma: WEHI-164)에 대하여 시험시, mTNFα-$APT_{EDB}$는 mTNFα에 비해 효능이 4배 가량 감소를 보였다. 그러나, 동일 세포주를 이용한 마우스 모델에서는, 전신 투여된 mTNFα-$APT_{EDB}$는 mTNFα 보다 효과적으로 종양 성장 억제하였으며, 눈에 띄는 독성을 나타내지 않았다. 이러한 항암 효능은 mTNFα-$APT_{EDB}$와 화학 약물요법인 melphalan과의 병행 투여에 의해 더욱 향상됨으로써, TNFα에 의한 혈관 투과성이 향상되어 종양에서의 화학약물요법의 흡수가 증가하고 시너지 효과를 일으킨다는 것을 시사하였다. 종합하면, 이러한 결과는 mTNFα와 암특이적 앱타이드의 융합 단백질이 전신 투여 후에도 낮은 독성으로 강력한 항암 효과를 보장하는 새로운 항암 치료제가 될 수 있음을 입증하였다.
3장에서는, 항체 정제를 위해 칼세퀘스트린(CSQ)과 Z-도메인 융합 단백질을 사용하여 칼슘 이온 유도에 의한 친화성 침전 방법 및 CSQ-$APT_{hFc}$ 융합 단백질의 제작을 위해 인간 항체의 Fc 단편(hFc) 특이적 앱타이드 ($APT_{hFc}$)의 스크리닝과 발굴에 대해서 기술하였다. 친화성 침전 방법은 환경 자극에 의한 작동상의 편리함으로 인해 치료용 항체 정제를 위한 기존의 크로마토그래피 방법의 대안이 될 수 있는 전략이다. CSQ는 인체내 존재하는 칼슘 결합 단백질 중 하나로써, 칼슘 이온에 의해 형성되는 CSQ의 중합체는 불용성 침전을 유도힌다. 이를 이용하여 본 연구에서는, 항체 정제를 위한 CSQ 과Z-도메인의 융합단백질(ZCSQ)를 제작하고 특성을 분석하였다. 5 mM의 칼슘 이온 농도로, ZCSQ는 ZCSQ/항체 복합체를 효과적으로 침전 시켰으며, 산성 완충액 (pH 3.5 나트륨 구연산염)에서 고순도로 항체를 방출하고, 마지막 단계로 칼슘 이온의 EDTA 를 통한 킬레이션에 의해 적어도 4 회 이상의 재 사용성을 보장했다. CHO 세포 배양 배지에서 ZCSQ 융합 단백질은 항체를 고순도로 정제하였으며, protein A 크로마토그래피 방법 보다 숙주 세포 유래의 DNA 오염을 효과적으로 제거 할 수 있음을 확인하였다. 특히, 칼슘 이온에 의해 유도된 ZCSQ/항체 복합체의 침전은 정제된 항체의 항원 결합 능력을 저해하지 않았으며, 임계 응집을 일으키지 않음을 확인하였다. 동시에, 스크리닝을 통해 선별된$APT_{hFc}$는 ~ 72 nM의 친화도로 hFc 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 증명하였으며, 이를 통해 $APT_{hFc}$가 항체 정제를 위한 차세대 비면역원성의 친화성 리간드로써, CSQ에 융합 가능한 항체 특이적 리간드 후보물질이 될 것으로 기대했다. 종합하면, 이 결과는 칼슘 이온과 CSQ 기반의 친화도 침전이 항체 정제를 위한 개념 증명(proof of concept)의 방법임을 입증하였다.
