The lung is the most vulnerable organ during sepsis, but disturbances in pulmonary microcirculation at the cellular level are poorly understood due to the limitation of adequate imaging tool. Here, we implemented a intravital lung imaging system integrated to a custom-design video-rate laser-scanning confocal microscopy platform to perform direct real-time visualization of pulmonary microcirculation.
We successfully observed rapidly flowing erythrocytes in pulmonary capillaries by fluorescence angiography using a dextran conjugated fluorophore. By delineating the red blood cell (RBC) exclusion zone inside ca-pillary, we defined the endothelial glycocalyx layer (EGL). Then we identified degradation of EGL in sepsis model, which represents the destructed barrier of vascular endothelium.
We observed that prolonged neutrophil entrapment within capillaries induced the development of dead space during sepsis-induced acute lung injury (ALI). We derived the functional capillary ratio (FCR) as a novel parameter for assessing the fraction of functional microvasculature in the pulmonary microcirculation and demonstrated that FCR rapidly decreased in the early stage of systemic inflammation. This decrease was the result of extended sequestration time and the arrest-like dynamic behavior of neutrophils, which triggered neutrophil thrombosis inside capillaries and arterioles. Finally, we found that Mac-1 (CD11b/CD18) was upregulated in neutrophils sequestered in the lung and that a Mac-1 inhibitor restored the FCR, suggesting that this inhibitor has potential as a therapeutic drug for sepsis-induced acute respiratory distress syndrome (ARDS).
폐는 패혈증에서 가장 취약한 장기이지만, 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상에서 세포 수준의 미세순환 변화는 영상 검사의 부재로 인하여 잘 알려지지 않았다. 본 연구에서는 실시간 영상 획득이 가능한 고해상도 레이저 주사 공초점 현미경을 자체 제작하여 폐 미세순환의 시각화에 성공하였다. 먼저, 형광 혈관조영술을 활용하여 모세혈관 내 적혈구 제한구역 영상을 획득하였고, 이를 기반으로 생쥐의 패혈증 모델에서 폐혈관 내피세포의 당질층의 분해를 확인하였다. 또한, 패혈증으로 인한 급성 폐 손상 때 중성구가 모세혈관 내에서 포획되어서 폐의 미세순환의 비관류영역을 형성하는 것을 관찰하였다. 이를 검증하기 위하여 기능적 모세혈관 면적비율 (FCR) 을 미세순환 내 관류 영역을 정량하는 지표로 새롭게 정의하였고, 전신적 염증의 초기에 이 지표가 감소하는 것을 확인하였다. 이는 폐로 유입된 중성구의 모세혈관 내 포획 시간 증가와 운동성 감소 성향으로 인하여 중성구가 모세혈관과 세동맥 내에서 미세혈전으로서의 역할을 수행하기 때문에 발생하는 현상임을 입증하였다. 마지막으로 폐 안에 격리된 중성구의 표면에서 Mac-1 인테그린이 상승해있음을 확인하였고, 나아가 Mac-1 억제제가 미세순환의 관류영역을 회복시키는 기전을 바탕으로 패혈증에 의한 급성 폐 손상에서 치료제로서의 가능성이 있음을 확인하였다.
