Chemotherapy has long been applied for the treatment of cancer. However, chemotherapy can cause various side effects due to their non-targetability and toxicity. Recently, cell-penetrating peptide (CPPs) have attracted attention as a safe non-viral vector. CPPs are composed of naturally occurring amino acids and can deliver a variety of substances because of its ability to penetrate cells. However, CPPs possess some limitations which are unstability and low delivery efficacy of high-molecular-weight substances because of its linear structure and short sequences. To overcome these drawbacks, it is necessary to develop the new types of CPPs.
In chapter 2, we designed a modified nona-arginine (mR9, Cys-R9-Cys-R9-Cys) and synthesized a branched-mR9 (B-mR9) using disulfide bonds. Redox-cleavability of B-mR9 was confirmed by treating reducing agents, which indicated that selective intracellular gene release was achieved. This novel CPP having branched structure demonstrated higher pDNA transfection efficacy and cell viability than conventional CPPs and PEI 25k. In the siRNA experiments, the B-mR9/VEGF siRNA (siVEGF) polyplex exhibited an incremental serum resistance and silencing effects in various cancer cell lines. To demonstrate the therapeutic efficacy in vivo, B-mR9/siVEGF was administered intravenously into NCI-H460 bearing mice. The mice treated with B-mR9 showed significant tumor inhibition compared to the other experimental groups without toxicity. The branched CPP will be probably used as the novel gene delivery platform.
In chapter 3, we synthesized a poly(L-methionine-block-L-lysine)-PLGLAG-PEG (MLMP) composed of a ROS-responsive methionine, a cell permeable lysine chain, and a protease-cleavable linker. The micelles formed by the methionine and lysine chain loads DOX, and the cell-permeability is masked by PEGylation. When the DOX-loaded MLMPs reach a tumor tissue, the linkers are cleaved by matrix metalloproteinase (MMP). After cleavages, the PEG chains are released and micelles can penetrate into cells by revealing cell-permeability. The phase transition of the methionine chain occurs due to abundant ROS in the cytosol of cancer cells, resulting in the collapse of the micelle structure and the release of DOX. We confirm ROS- and enzyme-responsiveness, and outstanding DOX delivery efficacy of the MLMP. In an in vivo study, its long retention with tumor targetability is confirmed by a bio-distribution analysis, and MLMP (DOX) exhibits significant tumor inhibition compared to free DOX. The ROS- and protease-responsive MLMP can likely be used as a novel drug delivery platform.
세포투과성 펩타이드는 5~30개의 천연 아미노산 시퀀스로 이루어져 있어 생체적합성이 뛰어난 물질임. 또한, 자체적인 세포투과능력이 있어 유전자, 항암제, 단백질 등 다양한 물질의 전달체로 활용되고 있음. 하지만 기존 세포투과성 펩타이드는 짧은 시퀀스로 이루어져 있고, 선형 구조를 띄므로 안정적인 파티클 형성 및 고분자량 물질에 대한 전달 능력이 떨어짐. 또한, 표적성이 상대적으로 약하기 때문에 인비보로의 적용에 어려움이 있음.
이러한 한계를 해결하고자, 본 연구에서는 안정성, 전달 효율 및 표적성을 개선한 향상된 세포투과성 펩타이드를 개발하였음.
첫 번째 연구에서는 기존 R9 펩타이드 양 말단과 가운데에 시스테인 시퀀스를 도입한 후, 이황화 결합을 형성하여 분자량이 약 40배 증가한 그물망 펩타이드 구조체를 개발하였음. 향상된 포집력과 안정성으로, 형광 단백질 발현 DNA 전달 시, 기존 세포투과성 펩타이드보다 10배 향상된 형질전환 효율을 보였음. 암 조직 주변의 혈관생성을 억제하는 VEGF siRNA를 전달한 결과, 관련 mRNA 발현을 약 70% 억제하였음. 또한, 동물실험에서는 무처리 실험군보다 5배 향상된 암 억제 효능을 보였으며, 혈액 적합성 및 조직 독성 시험에서 우수한 생체적합성을 나타냈음. 이러한 그물망 구조의 세포투과성 펩타이드는 다양한 유전자 전달 플랫폼으로 활용 가능함.
두 번째 연구는, 활성화 가능한 세포투과성 펩타이드 개발을 통한 암 표적성 강화임. 암세포 내에는 일반세포보다 활성산소가 풍부하며, 메티오닌은 이러한 활성산소와 반응하여 소수성에서 친수성으로 상변화 하는 특징이 있음. 메티오닌의 이러한 특성을 이용한 전달체는 아직 시도되지 않았기에 새로운 항암제 전달체로 활용하고자 함. 먼저, 메티오닌-라이신 기반의 폴리펩타이드를 합성하였고, 내부에 항암제 탑재 후, PEGylation을 통해 세포투과성을 억제했음. 체순환 중, 암 주변에 풍부한 특정 단백질에 의해 PEG 체인이 끊어지고, 세포투과성이 드러나면서 표적침투가 가능함. 침투 후에는 암세포 내 풍부한 활성산소에 의해 붕괴되어 항암제를 방출함. 세포 및 동물실험 결과 높은 항암효능과 생체적합성을 나타냄. 이는 소수성 약물의 탑재가 가능하기에, 다양한 항암제 전달 플랫폼으로 활용 가능함.
