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Process development of transient gene expression in mammalian cells for high biopharmaceutical production = 고생산성 바이오의약품을 위한 동물세포 기반 일시발현 생산 공정 개발
서명 / 저자 Process development of transient gene expression in mammalian cells for high biopharmaceutical production = 고생산성 바이오의약품을 위한 동물세포 기반 일시발현 생산 공정 개발 / Joo-Hyoung Lee.
저자명 Lee, Joo-Hyoung ; 이주형
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2018].
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Transient gene expression (TGE)-based recombinant protein production in biotechnologically important mammalian cells such as human embryonic kidney 293 (HEK293) cells and Chinese hamster ovary (CHO) cells has been a valuable technology for the past several years. Remarkable development of the TGE system was accomplished with the recombinant therapeutic protein yield increasing from mg/L to g/L due to huge demand for pre-clinical research and development purposes. This progression of TGE-based recombinant protein production is attributed to many factors: optimized efficient transfection reagents, an expression vector with strong gene expression, suitable cell lines, cell line-specific serum-free media, and an optimized cell culture process for suspension cells. Therefore, to improve the production of recombinant protein, this study focused on the cell engineering of mammalian cell lines such as HEK293 and CHO cells, expression vector engineering, and optimization of culture process for TGE-based recombinant protein production in mammalian cells. In an attempt to determine the relationship between the Epstein Barr virus nuclear antigen-1 (EBNA-1) expression level and specific foreign protein productivity (qp), EBNA-1-amplified HEK293 cells, which achieved a higher EBNA-1 expression level than that achieved by HEK293E cells, were established using dihydrofolate reductase (dhfr)-mediated gene amplification. Compared with a control culture in a null pool, Fc-fusion protein production by transient transfection in the EBNA-1-amplified pool showed a significant improvement. qp was linearly correlated with the EBNA-1 expression level in the transient transfection of EBNA-1-amplified clones, as indicated by the correlation coefficient (R2 = 0.7407). The Fc-fusion protein production and qp in a transient gene expression-based culture with EBNA-1-amplified HEK293 cells, E-amp-68, were approximately 2.0 and 3.2 times, respectively, higher than those in a culture with HEK293E cells. The increase in qp by EBNA-1 amplification mainly resulted from an enhancement in the amount of replicated DNA and level of mRNA expression but not an improved transfection efficiency. Taken together, it was found that EBNA-1 amplification could improve the therapeutic protein production in HEK293 cell-based TGE systems. Despite the relatively low transfection efficiency and low qp of CHO cell-based transient gene expression systems, TGE-based recombinant protein production technology predominantly employs CHO cells for pre-clinical research and development purposes. To improve TGE in CHO cells, EBNA-1/polyoma virus large T-antigen (PyLT)-co-amplified recombinant CHO (rCHO) cells stably expressing EBNA-1 and PyLT were established using dhfr/methotrexate (MTX)-mediated gene amplification. The level of transiently expressed Fc-fusion protein was significantly higher in the EBNA-1/PyLT-co-amplified pools compared to control cultures. Increased Fc-fusion protein production by EBNA-1/PyLT co-amplification resulted from a higher qp attributable to EBNA-1 but not PyLT expression. The qp for TGE-based production with EBNA-1/PyLT-co-amplified rCHO cells (EP-amp-20) was approximately 22.9-fold that of the control culture with CHO-DG44 cells. Rather than improved transfection efficiency, this cell line demonstrated increased levels of mRNA expression and replicated DNA, contributing to an increased qp. Furthermore, there was no significant difference in N-glycan profiles in Fc-fusion proteins produced in the TGE system. Taken together, these results showed that the use of rCHO cells with co-amplified expression of the viral elements EBNA-1 and PyLT improves TGE-based therapeutic protein production dramatically. Therefore, EBNA-1/PyLT-co-amplified rCHO cells will likely be useful as host cells in CHO cell-based TGE systems. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a highly contagious virus of swine with high morbidity and mortality in new born piglets. The S1 domain of the spike protein of PEDV is responsible for virus binding and fusion to the cellular receptor inducing a number of neutralizing antibodies. Therefore, we expressed recombinant S1 protein in HEK293 cell-based TGE systems for the development of efficient vaccines against PEDV. The recombinant S1 protein with human Fc region (S1-Fc) was successfully expressed in a secretory form in HEK293 cells. Affinity purified recombinant S1-Fc protein was analyzed by SDS-PAGE, Western blot, and size-exclusion chromatography. The human-derived seven signal peptides were then evaluated for their impacts on the production of recombinant S1-Fc protein in HEK293 cell-based TGE systems. Also, tagging of recombinant S1-Fc protein with oligomerization domain such as GCN4 and foldon was assessed for potential formation of trimeric structure. It was observed that the maximum recombinant S1-Fc protein production with thrombopoietin isoform 1 precursor (THPO) was 1.5-fold of higher than that in native signal peptide of S1 protein. We also found that the ability of vaccination with the recombinant S1 protein against PEDV. The purified recombinant S1-THPO-Fc protein with GCN4 was shown to mediate highly potent antibody responses in PEDV whole virus antigen. These results show that recombinant S1 protein expressed in HEK293 cell-based TGE systems will be promising method for an efficient subunit vaccine for PEDV prevention. For high-level production of heterologous therapeutic proteins, the mostly widely used mammalian expression systems in biopharmaceutical industry is the dhfr/MTX-mediated gene amplification system. In particular, dhfr/MTX-mediated gene amplification procedure is a based on the use of dhfr-deficient CHO cell lines such as CHO-DG44 and CHO-DXB11. However, the use of gene amplification approach has been restricted due to the limitation of mammalian cell lines that lack the amplifiable genes. In an attempt to develop the dhfr-deficient HEK293 cell lines, expression vector containing short hairpin RNA (shRNA) that targeting the 3′-untranslated region (3′-UTR) of endogenous dhfr was applied for amplifying the foreign gene in wild-type HEK293 cell lines. shRNAs were designed to target the 3′-UTR of endogenous dhfr specifically, and then efficiently down-regulated dhfr expression of HEK293 cells. The shRNA-2 decreased the mRNA expression level of endogenous dhfr by 52%. The protein expression level of endogenous dhfr also reduced by the action of shRNA-2. The EBNA-1 expression levels of shRNA/EBNA-1-amplified pools were successfully amplified by stepwise increments of MTX concentration. As a result, compared with a Null, the qp increased by more than 2.0 times in shRNA/EBNA-1-amplified pool at 100 nM MTX. Taken together, combining shRNA by downregulation of endogenous target gene and gene amplification approach could be potentially applied for amplifying the target gene in wild-type cell lines.

Human embryonic kidney 293 (HEK293) 세포, Chinese hamster ovary (CHO) 세포와 같은 동물세포는 일시발현 (transient gene expression)을 기반으로 한 재조합 단백질 생산에 유용하게 사용되고 있다. 동물세포 기반 일시발현 시스템을 이용하여 생산된 재조합 단백질은 전임상 및 초기 신약 스크리닝 분야에 주로 사용되고 있고, 최근 다양한 연구를 통해 단백질 생산량이 g/L 수준까지 도달하였다. 일시발현 기반 재조합 단백질 생산성 증가는 효과적인 트렌스펙션, 강력한 발현 벡터, 적합한 세포주, 무혈청 배지 선정, 배양 공정 최적화 등 많은 요인에 기인한다. 본 연구는 세포 공학, 발현 벡터 공학, 그리고 배양 공정 최적화를 통해 동물세포를 이용한 일시발현 기반 바이오의약품 생산성을 극대화하고자 하였다. 에피솜 복제 및 유지 (episomal replication and retention)와 관련되어 있다고 알려진 EBNA-1의 발현양과 외부 단백질 생산성 (qp, specific protein productivity)의 상관관계를 규명하기 위해, dihydrofolate reductase (dhfr)/methotrexate (MTX) 매개 유전자 증폭 시스템을 이용하여 EBNA-1이 증폭된 HEK293 세포주를 확립하였다. EBNA-1 증폭 HEK293 세포주가 기존의 HEK293E 세포보다 높은 EBNA-1 발현양을 보이는 것을 확인하였다. 확립된 EBNA-1 증폭 HEK293 세포주에 외부 단백질을 일시발현 시켰을 때, EBNA-1 증폭 HEK293 세포주는 대조군 대비 유의적으로 높은 단백질 생산성을 보였고, EBNA-1 발현양과 단백질 생산성은 높은 상관관계가 있음을 확인하였다(R2 = 0.7407). 특히, E-amp-68 세포주는 대조군 대비 약 2배 높은 생산량, 약 3.2배 높은 생산성을 보였다. EBNA-1 증폭에 따른 생산성 향상은 세포 내 복제된 DNA (replicated DNA) 양과 mRNA 발현양 증가에 기인한 것으로 관찰되었다. 결론적으로, HEK293 세포 기반 일시발현 시스템에서 HEK293 세포의 EBNA-1 증폭은 치료용 단백질 생산을 유의적으로 증가시킬 수 있다. CHO 세포 기반 일시발현 시스템을 이용한 재조합 단백질 생산 기술은 상대적으로 낮은 트렌스펙션 효율과 낮은 생산성에도 불구하고, 전임상 실험 및 초기 신약 연구 스크리닝에 많이 사용되고 있다. CHO 세포를 이용한 일시발현 기반 단백질 생산성을 향상시키기 위해, dhfr 유전자 증폭 기술을 이용하여 EBNA-1과 PyLT가 동시 증폭된 CHO 세포주를 확립하였다. 확립된 EBNA-1/PyLT 동시 증폭 CHO 세포주에 외부 단백질을 일시발현 시켰을 때, EBNA-1/PyLT 동시 증폭 CHO 세포주는 대조군 대비 유의적으로 높은 생산성을 보였는데 이는 주로 EBNA-1 발현량 증가에 따른 것으로 확인되었다. 특히, EP-amp-20 세포주는 대조군 대비 약 22.9배 높은 생산성을 보였는데, 이러한 높은 생산성은 트렌스펙션 효율과는 상관없이 세포 내 복제된 DNA 양과 mRNA 발현양의 증가에 따른 것으로 관찰되었다. 또한 EBNA-1/PyLT 동시 증폭 CHO 세포주에서 생산된 단백질의 N-당사슬 (N-glycan) 패턴을 분석한 결과, 다른 야생형 CHO 세포에서 생산된 단백질의 N-당사슬 패턴과 유사한 것으로 확인되어, EBNA-1/PyLT 동시 증폭은 단백질의 N-당사슬 패턴에 어떠한 영향도 미치지 않음을 확인하였다. 결론적으로, EBNA-1/PyLT 동시 증폭 CHO 세포주는 일시발현 시스템을 통한 치료용 단백질 생산성을 유의적으로 증가시킬 수 있고, CHO 세포를 기반으로 한 일시발현 생산 시스템의 유용한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV)는 돼지에게 발병하는 전염성이 강한 바이러스이며, 특히 신생자돈에게 발병했을 경우 폐사율이 매우 높다고 알려져 있다. 돼지 유행성 설사병 바이러스 표면의 스파이크 단백질을 구성하고 있는 S1 도메인은 세포와 결합 및 융합을 일으켜 중화항체 형성을 유도한다고 보고되고 있다. 돼지 유행성 설사병을 예방할 수 있는 효과적인 백신 서브유닛 (subunit) 생산을 위해, 본 연구는 HEK293 세포 기반 일시발현 시스템을 이용하여 재조합 S1 단백질 생산 관련 연구를 수행하였다. 재조합 S1-Fc 단백질이 HEK293 세포로부터 성공적으로 일시발현 되어 세포 밖으로 분비되는 것을 확인하였다. 다양한 인간 유래 signal peptide를 도입하고 일시발현 기반 재조합 S1 단백질 생산량을 평가한 결과, thrombopoietin isoform 1 precursor (THPO) signal peptide가 대조군 대비 1.5배 높은 생산량을 보였다. 또한 재조합 S1 단백질의 안정적인 삼량체 (trimeric) 구조 형성을 위해 yeast 유래의 GCN4를 도입한 결과, 대조군 대비 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원에 대해 높은 면역 반응을 유도하는 것으로 확인하였다. 결론적으로, HEK293 세포 기반 일시발현 시스템을 통해 생산된 재조합 S1 단백질은 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 고생산성 치료용 단백질 생산을 위해, 바이오의약품 산업에서 가장 많이 사용되고 있는 기술은 dhfr/MTX 매개 유전자 증폭 시스템이다. dhfr/MTX 매개 유전자 증폭 시스템을 사용하기 위해서는 dhfr 유전자가 결여된 세포주가 필요하지만, 실제로 CHO-DG44 또는 CHO-DXB11 등 CHO 세포주를 제외하고 유전자 증폭 시스템을 적용할 수 있는 동물세포는 현재까지 전무한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 short hairpin RNA (shRNA)를 이용하여 야생형 HEK293 세포의 endogenous dhfr 유전자를 억제하고, 동시에 EBNA-1과 exogenous dhfr 유전자를 도입함으로써 dhfr/MTX 매개 유전자 증폭 가능성 및 이로 인한 일시발현 기반 단백질 생산성 증가 여부에 대해 조사하였다. 야생형 HEK293 세포의 endogenous dhfr 3′-untranslated region (3′-UTR)을 억제하는 shRNA를 제작하고, EBNA-1, exogenous dhfr, shRNA가 동시에 포함된 벡터를 도입한 결과, endogenous dhfr이 효과적으로 저해되는 것을 확인하였다. shRNA가 안정적으로 도입된 HEK293 세포에 MTX를 첨가한 결과, MTX 농도가 증가함에 따라 EBNA-1 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 확립된 EBNA-1 증폭 HEK293 세포주에 외부 단백질을 일시발현 시켰을 때, EBNA-1 증폭 HEK293 세포주는 대조군 대비 약 2배 높은 단백질 생산성을 보였다. 결과적으로, 타겟 유전자의 3′-UTR을 효과적으로 저해할 수 있는 shRNA의 도입은 일시발현 시스템을 이용한 단백질 생산성을 향상시킬 수 있는 새로운 전략이 될 수 있고, 이러한 방법은 다양한 야생형 동물세포주 및 유전자 증폭 시스템에도 이용 가능할 것으로 사료된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 18011
형태사항 xii, 97 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 이주형
지도교수의 영문표기 : Gyun Min Lee
지도교수의 한글표기 : 이균민
수록잡지명 : "Investigation of relationship between EBNA-1 expression level and specific foreign protein productivity in transient gene expression of HEK293 cells". Process Biochemistry, v.55, pp. 182-186(2017)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 79-91
주제 TGE
HEK293
CHO cells
Gene amplification
EBNA-1
PyLT
Vaccine
shRNA
일시발현
HEK293 세포
CHO 세포
유전자 증폭 시스템
EBNA-1
PyLT
백신
shRNA
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