From the first approval of biotherapeutic protein in 1982, the technologies for their production have developed substantially. Although over 70% of biotheriapeutic proteins have been produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells, there has been a recent shift toward the use of human cell lines because of their human-derived post-translational modifications (PTMs). Human embryonic kidney (HEK) 293 cells has been extensively used as an expression tool for recombinant proteins in scientific research. Recently, HEK293 cell lines were also used for the stable production of complex biotherapeutic proteins because their human-like PTMs, suspension-free culture, and high transfection efficiency among human cell lines. However, lack of efficient selection system was regarded as limitations for using HEK293 cells as a stable host cell line. Glutamine sytnehtase (GS) ？ mediated gene amplification system is one of stable protein production systems used in industrial field to isolate high-producing clonal cells. In this study, GS-mediated gene amplification system was applied in HEK293 cells for stringent and effective selection for high-producing clonal cell lines.
To investigate the feasibility of GS-mediated gene amplification in HEK293 cells for the high-level stable production of therapeutic proteins, HEK293E cells were transfected by the GS expression vector containing antibody genes and were selected at various methionine sulfoximine (MSX) concentrations in 96-well plates. For a comparison, CHOK1 cells were transfected by the same GS expression vector and selected at various MSX concentrations. Unlike CHOK1 cells, HEK293E cells producing high levels of antibodies were not selected at all. For HEK293E cells, the number of wells with the cell pool did not decrease with an increase in the concentration of MSX up to 500 μM MSX. A q-RT-PCR analysis confirmed that the antibody genes in the HEK293E cells, unlike the CHOK1 cells, were not amplified after increasing the MSX concentration. It was found that the GS activity in HEK293E cells was much higher than that in CHOK1 cells (P < 0.05). In a glutamine-free medium, the GS activity of HEK293E cells was approximately 4.8 times higher than that in CHOK1 cells. Accordingly, it is inferred that high GS activity of HEK293E cells results in elevated resistance to MSX and therefore hampers GS-mediated gene amplification by MSX. Thus, in order to apply the GS-mediated gene amplification system to HEK293 cells, the endogenous GS expression level in HEK293 cells needs to be minimized by knock-out or down-regulation methods.
Previously, it was inferred that a high GS activity in HEK293E cells results in elevated resistance to MSX and consequently hampers GS-mediated gene amplification and selection by MSX. To overcome this MSX resistance in HEK293E cells, a GS-knockout HEK293E cell line was generated using the CRISPR/Cas9 system to target the endogenous human GS gene. The GS-knockout in the HEK293E cell line (RK8) was confirmed by Western blot analysis of GS and by observation of glutamine-dependent growth. Unlike the wild type HEK293E cells, the RK8 cells were successfully used as host cells to generate a recombinant HEK293E cell line (rHEK293E) producing a monoclonal antibody (mAb). When the RK8 cells were transfected with the GS expression vector containing the mAb gene, selection efficiency was decreased by MSX and rHEK293E cells producing the mAb could be selected in the absence as well as in the presence of MSX. The gene copies and mRNA expression levels of the mAb in rHEK293E cells were also quantified using qRT-PCR. In addition, the stability of rHEK293E clones were sustained in the presence of selection pressure. Taken together, the GS-knockout HEK293E cell line can be used as host cells to generate stable rHEK293E cells producing a mAb through GS-mediated gene selection in the absence as well as in the presence of MSX.
In conclusion, the GS/MSX system for isolating high-producing clonal cells successfully applied in HEK293E cells by minimizing the MSX resistance of HEK293 cells, which derived by high-level of endogenous GS expression in HEK293E cells. The GS-HEK293 system can be used for the protein production in human-derived cell line, especially for the production of complex proteins.
1982년 최초로 바이오 의약품이 허가된 이후로, 바이오 의약품의 생산 기술은 상당히 발전하고 있다. 현재 70% 이상의 바이오 의약품이 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 생산되고 있지만, 최근 인간형 단백질 번역 후 변형 (PTMs, Posttranslational modifications) 과정을 수행할 수 있는 인간 유래 세포의 이용이 점차 증가하고 있다. Human embryonic kidney (HEK) 293 세포는 과학 분야에서 외부 단백질을 생산하기 위한 도구로 많이 사용되었다. 최근에 들어서, HEK 293 세포는 인간형 PTM 과정, 부유 배양 및 높은 transfection 효율 때문에 복잡한 바이오 의약품의 안정 생산에 이용되고 있다. 그러나, 효율적인 선별시스템의 부재는 HEK293 세포를 안정생산의 숙주 세포주로 사용하는데 걸림돌로 작용하고 있다. Glatamine synthetase (GS) 기반 유전자 증폭 시스템은 고생산 세포 클론을 얻기 위하여 산업계에서 사용되는 안정 생산 시스템이다. 본 연구에서는 고생산 세포 클론을 효과적으로 선별하기 위하여 GS 기반 유전자 증폭시스템을 HEK293 세포주에 적용하였다.
먼저, HEK293 세포에서의 GS 기반 유전자 증폭 시스템의 실현 가능성을 확인하였다. 항체 유전자를 포함하는 GS 발현 벡터로 transfection된 HEK293 세포는 96-well plate에서 여러 농도의 methionine sulfoximine (MSX)에 의해 선별 되었다. 비교를 위하여 CHOK1 세포도 동일한 벡터로 transfection 된 후, 여러 농도의 MSX에 의해 선별 되었다. 그러나 CHOK1 세포와 달리 HEK293E 세포는 500 μM이 넘는 농도의 MSX에서도 세포가 자라는 well의 개수가 감소하지 않았다. q-RT-PCR 분석결과에 따르면, CHOK1 세포와 달리 HEK293 세포에서는 MSX 농도가 올라가더라도 항체 유전자가 증가하지 않았다. HEK293 세포의 GS 활성은 CHOK1 세포보다 훨씬 높은 것으로 밝혀졌다 (P<0.05). 글루타민이 없는 배지에서 HEK293 세포의 GS 활성은 CHOK1 세포보다 약 4.8배 높았다. 따라서, HEK293E 세포의 높은 GS 활성이 MSX에 대한 내성을 증가시켜 MSX에 의한 GS 기반 유전자 증폭을 방해하는 것으로 추측할 수 있다. 따라서, GS 기반의 유전자 증폭 시스템을 HEK293 세포에 적용하기 위해서는, HEK293 세포가 가진 내인성 GS 발현 수준을 down-regulation 또는 knockout 방법을 통해 최소화 할 필요가 있다.
이전 연구에서, HEK293 세포의 높은 GS 활성이 MSX 내성을 증가시켜, GS 기반의 유전자 증폭 및 MSX에 의한 선택을 방해한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, HEK293 세포에서의 MSX 내성을 극복하기 위하여, GS 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 GS가 knockout된 HEK293E 세포주를 개발하였다. GS가 knockout 된 HEK293 세포주 (RK8)는 GS 단백질의 Western blot 분석과, 글루타민 의존 성장 패턴을 통해 확인하였다. Wild type HEK293E 세포와 달리, RK8 세포는 단일클론항체를 생산하는 세포주 (rHEK293E)를 구축하기 위한 숙주 세포주로 이용될 수 있었다. 항체 유전자를 포함하는 GS 발현 벡터에 의해 transfection된 RK8 세포는 MSX 선별 과정에 동안 선택 효율이 감소하였으며 단일클론항체를 생산하는 rHEK293 세포들이 구축 되었다. 구축된 rHEK293E 세포의 gene copy 및 mRNA 발현 정도가 qRT-PCR 방법에 의하여 정량화 되었다. 또한, rHEK293E 세포주들의 안정성이 selection pressure가 있는 상황에서 유지되는 것을 확인하였다. 이를 종합하여, GS-knockout HEK293E 세포주는 GS 기반의 유전자 선별 시스템의 숙주 세포주로 사용할 수 있으며, GS에 의한 유전자 선별 과정을 통하여 MSX가 존재/부재한 상황에서 항체 생산 세포주 구축에 이용할 수 있다.
결론적으로, GS/MSX 시스템을 통한 고생산 세포주 선별은 HEK293 세포에서 높은 GS 발현에 의한 MSX 내성을 최소화 함으로 효과적으로 적용되었다. GS-HEK293 세포는 이후 인간 유래 세포주 에서의 단백질 생산, 특히 복잡한 단백질 생산에 사용될 수 있다.
