Fine-tuning of gene expression is essential for optimization of metabolic and genetic networks, but conventional methods are time-consuming and laborious. Here, we report the development of a fine-tunable knockdown system by modulating synthetic small RNA (sRNA) expression levels in Escherichia coli. A library of 75 synthetic sRNAs-promoter combinations was constructed for the enhanced production of putrescine, an engineering plastic monomer. Optimal repression of argF and glnA using sRNAs led to rapid development of an engineered E. coli strain capable of producing 43.0 g/l of putrescine by fed-batch cultivation. Similarly, through fine-tuned repression of argF and glnA by applying 25 sRNAs-promoter combinations, an engineered E. coli strain capable of producing 32.7 g/l of L-proline by fed-batch culture could be developed. The fine-tuning system of modulating synthetic sRNA expression levels reported here will be useful for the optimal and rapid design of microbial strains through simultaneous optimization of multiple gene expression levels at the systems level. This strategy will serve as a good complementing alternative to individually re-designing sRNAs in an sRNA-based gene expression knockdown system.
The dissection of small regulatory RNA scaffold structure was also performed to enhance the knockdown activity of sRNA and to develop a tuned knockdown tool in the absence of series of synthetic promoters. The mutational study was carried out based on SgrS, one of well-studied sRNAs, and the importance of stem length and sequence of a loop of Hfq, an RNA chaperone binding site, was found. Based on these observations, the knockdown activity of sRNA is able to be strengthened and weakened by inserting mutations in the scaffold.
생명체의 복잡하게 얽혀있는 대사회로 및 유전자회로를 최적화 하기 위해서 유전자 미세조절은 필수적인 과정이나 기존의 기법들은 시간과 노력이 많이 소모되는 작업이었다. 이를 극복하기 위하여 합성 조절 sRNA의 발현량 및 돌연변이 구조체를 이용한 유전자 발현 미세조절 기법을 개발하여 제시하였다. 합성 조절 sRNA는 mRNA를 억제할 때 합성 조절 sRNA의 발현량에 비례하여 목표 유전자가 억제됨을 이용하여 다양한 프로모터를 활용한 유전자 발현 미세조절 기법이 개발되었으며 이를 이용하여 푸트레신 균주의 성능을 향상시키는 연구를 수행하였다. 75가지 합성 조절 sRNA - 프로모터 조합을 이용하여 억제 목표 유전자를 스크리닝하였다. argF와 glnA 유전자를 억제시킬 때에 균주의 성능이 크게 향상되는 것을 확인할 수 있었으며, 이들 유전자의 동시 억제를 섬세하게 최적화하여 고성능의 푸트레신 생산 균주를 개발하였다. 푸트레신 생산과 유사한 대사회로를 지니는 프롤린 생산 균주를 제작하여 푸트레신 균주 향상에 사용된 억제 목표 유전자가 유효함을 확인하였고 위의 두 유전자의 동시 억제를 수행하여 고성능의 프롤린 생산 균주를 제작하였다. 위의 연구 과정에서 프로모터를 이용한 sRNA의 발현량 조절만으로는 sRNA를 이용한 유전자 조절능이 충분하지 않은 경우도 있을 것을 감안하여 sRNA 자체의 유전자 억제능을 향상시키는 연구를 수행하였으며, SgrS-S sRNA 구조체를 돌연변이 도입을 통한 분석을 통하여 기존 SgrS-S 구조체 대비 3배까지 유전자 억제능이 향상된 sRNA 구조체를 개발하였다. 이들 sRNA를 이용한 유전자 발현 미세조절 기작들은 염색체 상의 유전자 발현을 용이하게 미세조절할 수 있는 도구들로 대사공학과 합성생물학을 비롯한 다양한 분야에서 강력한 도구로 활용될 것이 기대된다.
