The vertebrate neural cell development is coordinated process of neural stem cell (NSC) and finally produce mature layer and structure through diverse specification and differentiation. To preserve vertebrate neural progenitor cell (NPC), Notch signaling in neural progenitor cells is activated by ligands expressed in adjacent cells. During retinal development, retinal progenitor cells (RPCs) generate seven major cell types, two types of photoreceptors (Rod cells, Cone cells), interneurons (bipolar cells, horizontal cells, astrocytes), and M$\ddot{u}$ller glia, in chronological sequence. To identify sources of functionally active Notch ligands for RPCs, I negatively regulated Notch ligand activities through the specific elimination of an ubiquitin E3-ligase Mindbomb1 (Mib1) in RPCs, post-mitotic retinal neurons (PMNs), and retinal pigment epithelium (RPE), respectively. The Mib1-deficient RPCs failed to induce Notch activation in intra-lineage RPCs, which prematurely differentiated into retinal neurons. However, the Mib1-deficient PMNs shows no significant difference between wild-type which means Notch signaling between PMNs and RPCs is dispensable. Lastly, I found that Mib1 in RPE was crucial for Notch activation in RPC. I discover a novel function of embryonic RPE that expresses Notch ligands at the apical membrane that contact with RPC apical membrane to trigger Notch activation in a future RPC. To confirm this, we conducted rescue experiments using LSL-Dll1 (loxP-Stop-loxP) line which expresses Dll1 (one of Notch ligand in RPE) under Cre expression. As a result, Mib1-deficient RPE with ectopic expression of Dll1 rescues the abnormal retinal development phenotypes which showed in Mib1-deficient RPE mice. Together, I propose a model that a RPC daughter receives additional Notch signals from RPE to acquire RPC fate competitively while the other sister cell only receives a sub-threshold inter-RPC Notch signaling to differentiate to retinal neuron.
망막의 발생은 다양한 신호 체계의 정교한 조절에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 망막은 망막전구세포(RPC)로부터 7가지의 주요 세포형으로 분열하게 되며 발생이 완료되면 잘 짜여진 구조를 형성하게 된다. 망막 발생 과정에 관여하는 신호전달체계 중 하나인 Notch 신호전달체계는 망막 신경세포 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 연구는 망막 발생 과정 중에 세포간에 일어날 수 있는 Notch 신호전달체계를 세포 종류 별로 나누어 연구를 진행하였고, 망막상피세포(RPE) 와 망막전구세포(RPC) 간 Notch 신호전달체계를 통해 망막의 발생과 분화에 영향을 미치는 새로운 역할을 규명하였다. Notch 신호전달체계를 조절하는 방법으로 리간드(ligands)의 활성화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 Mindbomb1 (Mib1) 결손 생쥐를 이용하여 망막전구세포(RPC)와 인접하여 Notch 신호전달체계를 활성화 할 수 있는 망막전구세포(RPC), 분화신경세포(PMN), 망막상피세포(RPE)에서 Notch 신호전달체계의 역할을 구분하였다. 서로 다른 프로모터를 가진 Cre 생쥐 라인을 이용하여 각기 다른 세포에서 Mib1을 결손시켜 연구를 진행하였다. 망막전구세포(RPC)간의 Notch 신호전달체계는 이미 알려진 연구들의 결과와 같이 새포내계통(intra-lineage) 분화에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였고, 분화신경세포(PMN)로부터 망막전구세포(RPC)로 오는 Notch 신호전달체계는 정상적인 망막 발생과는 무관하다는 사실 또한 새롭게 밝혔다. 본 연구에서 새롭게 밝혀낸 망막상피세포(RPE)로부터 망막전구세포(RPC)로 오는 Notch 신호전달체계는 서로간의 접착 결합을 통해 이루어진다는 것을 전자현미경(TEM)을 통해 확인하였고, 이 결합을 통해 활성화된 리간드를 제공해 세포 분열 때 추가적인 Notch 신호를 얻게 된 망막전구세포(RPC)는 그대로 같은 전구세포(RPC)로 남게 되고 받지 못한 다른 하나는 새로운 신경세포로 분화하게 된다는 사실을 알아냈다. 이러한 결과가 Notch 신호체계에 의한 조절임을 다시 한 번 확인하기 위해, LSL-Dll1 생쥐 라인을 이용하여 리간드인 Dll1을 발현시켰을 때 Mib1 결손 생쥐에서 나타난 표현형(phenotype)이 정상적으로 복구됨을 확인 할 수 있었다. 또한, 망막전구세포(RPC)의 분화 시에 분화각도(division angle)를 변화시켜 Mib1 결손 생쥐에서는 신경발생(neurogenesis)이 증가하는 대칭분열(symmetric division)이 더 많이 일어남을 확인 할 수 있었다.
