Probing protein-protein interactions in living cells is crucial for understanding the protein functions and drug development. Small-sized protein binders are considered effective and useful for such analysis. Here we describe the development and use of a repebody, which is a protein binder composed of LRR (Leucine-rich repeat) modules, for tracking protein-protein interaction and localization in real-time. We developed an anti-mRFP repebody through a phage display method. Moreover, we designed an efficient and an EGFR-specific delivery platform using repebody to transport protein into the cells.
In Chapter 1, a repebody with high affinity for a red fluorescent protein was selected through a phage display, fused with a green fluorescent protein, and applied for tracing a red fluorescent protein-fused target protein in mammalian cells. We have also demonstrated that a repebody can be effectively used for the analysis of protein-protein interaction in living cells by live-cell imaging.
Chapter 2 describes the development of EGFR-specific repebody based delivery platform for receptor-specific intracellular delivery of cargos. We have shown that intracellular delivery of green ？uorescent protein (GFP) and gelonin toxin into the cytoplasm of mammalian cells. In consistent with an expression level of EGFR, repebody delivery system showed green fluorescence and cytotoxicity effects in mammalian cells in a dose dependent manner.
In this study, we successfully developed a repebody for targeting intracellular protein and repebody based delivery platform in living cells. Our results suggest that the developed repebodies can be widely used for the analysis of protein-protein interaction and an understanding of complex biological processes in living cells. Furthermore, the present approach of repebody immunotoxin can be a new therapeutic agent for the treatment of cancer.
세포 내의 단백질-단백질 상호작용을 규명하는 일은 각 단백질의 기능을 이해하고 새로운 신약개발을 위해 굉장히 중요하다. 이와 관련한 연구를 위해 작은 크기의 인공항체를 이용하여 상호작용을 분석하는 것은 기존의 항체를 이용한 방법보다 더 유용하다. 이에, 본 연구에서는 인공항체인 리피바디를 기반으로 살아있는 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 실시간으로 분석하였다. 적색형광단백질에 결합하는 리피바디를 개발하였고 상피세포성장인자수용체에 결합하는 리피바디를 이용한 세포 내 전달 체계를 구축하는 연구를 수행하였다.
제 1장에서는 파지 디스플레이 방법을 이용하여 적색형광단백질에 결합하는 리피바디를 개발하였고 이 리피바디와 녹색형광단백질을 함께 동물 세포에서 발현함으로써 세포 내 단백질들의 상호작용을 실시간으로 추적할 수 있었다. 또한 살아있는 세포 내에서 적색형광단백질-미세소관 결합단백질의 위치를 특이적으로 분석할 수 있음을 확인하였다.
제 2장에서는 상피세포성장인자수용체에 특이적으로 결합하는 리피바디를 이용하여 세포 내로 특정 물질을 전달할 수 있는 리피바디의 개발에 관한 내용을 기술하였다. 녹색형광단백질과 젤로닌 독소를 동물 세포질로 효율적으로 전달할 수 있는 전달 체계를 개발하였고 이를 공초점 현미경과 세포 내 독성평가를 이용하여 증명하였다. 또한, 상피세포성장인자수용체 발현 정도에 따라 개발한 전달 체계를 이용한 단백질 전달 효율이 조절되고 유방암세포 모델에서 종양의 성장을 억제하는 치료제로서의 가능성을 확인하였다.
위의 연구들을 통해 세포 내 단백질을 표적하고 세포 내 존재하는 단백질을 세포질로 전달할 수 있는 리피바디를 성공적으로 개발하였다. 이와 같은 결과는 리피바디가 세포 내에서 중요 단백질을 표적하고 세포 내 단백질 상호작용을 추적할 수 있는 인공항체로 쓰일 수 있음을 시사한다. 이는 기초 과학 연구와 신약 개발에 많은 도움을 줄 것이라 기대된다. 나아가 세균 독소와 리피바디를 이용한 세포 내 전달 체계는 다양한 물질을 세포질로 전달함으로써 다양한 질병의 치료제로 시용될 수 있을 것으로 기대된다.
