A metabolic potential of genetically engineered E. coli as expressed by rate and yield of foreign protein production was studied. The lipase from Pseudomonas fluorescens and human lymphotoxin (hlymphotoxin) were produced in the different physiological states of E. coli. Whereas the lipase synthesis controlled by tac promoter was continued for about 4 h after IPTG induction, the hlymphotoxin controlled by T7 promoter was synthesized for about 2 h after IPTG induction. The duration of synthetic phase of two proteins were irrespective of expression rates and yields, which were manipulated by using α-methyl glucose (α-MG), a competitive inhibitor of glucose. Therefore the expression rate after induction would determine the final expression yield of foreign lipase and hlymphotoxin in E. coli. By measuring the specific oxygen uptake rate ($qO_2$), specific $CO_2$ evolution rate ($qCO_2$), specific glucose uptake rate (qs) and intracellular protease level, the limited duration of expression phase was found to be caused by the metabolic stress due to rapid and massive production of foreign protein. The expression periods of both proteins were considerably reduced to less than a half of normal period of each protein by the addition of menadione, a redox cycling drug, seemingly due to the acceleration of energetic flow of host cells after induction. In contrast, the productive phases of both proteins were extended to 8 and 5 h, respectively, in glucose-starved condition although the final expression level was much lower than that in glucose-surplus condition. Temperature shock on the cell and foreign protein expression also controled the synthetic duration of both proteins. Based on these observations, it could be suggested that E. coli exhibits the restrained capacity of foreign protein production because of the metabolic stress due to the explosive synthesis of foreign protein under the strong promoters. In order to evaluate the acetate (-) mutant of E. coli as a potential host of foreign lipase expression and D-lactate production, pta(phosphotransacetylase) (-) mutant was constructed for the purpose of blocking the acetate synthetic pathway. Since the acetate was known as a major inhibitory by-product of cell growth and foreign protein production, growth characteristics and expression kinetics of microbial lipase in pta(-) mutant of E. coli were investigated. Growth rate was considerably decreased (about 30%) when grown on M9 minimal media containing glucose, mannose or glycerol. The growth retardation was not observed when gluconeogenic carbon source (acetate, malate, fumarate or succinate) was utilized. Growth inhibition of pta(-) mutant by menadione was more pronounced than that of the parental type of E. coli. Furthermore, the inhibition effect was the most serious in glucose minimal medium, whereas the menadione sensitivity was not observed when gluconeogenic carbon source was used as a sole carbon source or lactate dehydrogenase (LDH) gene from Lactobacillus casei was introduced in pta(-) mutant. When the mutant was cultivated under anaerobic condition, 68% of glucose, transported into the cells, was converted to D-lactate. Therefore, it was suggested that the growth deficiency of pta(-) mutant was closely related to the intracellular balance of redox state. When the pseudomonads' lipase was expressed in the pta(-) mutant, a comparable expression rate and yield to the parental type strain was observed. High cell density culture of the pta(-) mutant was easy to achieve the dry cell weight of 75 g/L even under the fluctuating condition of residual glucose concentration.
대장균을 숙주로 하여 외래단백질을 대량발현시킬때 단백질의 발현속도와 발현수율을 측정함으로써 이 재조합 대장균의 대사능력을 분석하였다. Pseudomonas fluorescens유래의 리파제와 사람의 lymphotoxin의 두 외래단백질을 여러생리상태에 있는 대장균내에서 발현시켜 보았다. tac-전사조절인자 (promoter)의 조절을 받는 리파제는 IPTG (isopropyl β - D - thiogalacto pyranoside)에 의해 발현이 시작된 이후 약 4시간 동안 합성이 유지됐으며 T7-전사조절인자의 조절을 받는 lymphotoxin에서는 약 2시간 동안 유지됨이 관찰되었다. 이같은 발현 기간은 기질인 글루코스의 경쟁적 저해제인 α-methyl glucose에 의해 조절되는 발현속도와 발현수율의 변화에 관계없이 일정하였기 때문에, 재조합 대장균에서의 외래단백질의 최종 발현수율은 결국 발현속도에 의해 결정되어짐을 알 수 있었다.
비산소소비속도, 비이산화탄소발생속도, 비글루코스소비속도, 그리고 세포내의 단백질분해효소량 등의 변화를 측정한 결과, 이같은 제한된 발현 기간은 외래단백질이 빠른속도로 대량발현될때 숙주세포에 가해지는 대사적 부담(metaboilc stress)때문인 것으로 확인되었다. 산화반응 촉진제인 menadione 을 사용하여 두 외래단백질 발현 이후의 숙주세포의 에너지 흐름을 촉진시킨 결과 발현기간을 각각 절반 이하로 줄일 수 있었다. 반면에, 글루코스가 결핍된 상태에서의 발현을 통해 발현기간을 각각 8시간과 5시간으로 늘릴 수 있었지만 두 단백질 모두 발현 수율은 현저히 감소되었다. 이상의 결과로부터 재조합대장균에서 강력한 전사조절인자에 의해 외래단백질을 발현시키는 경우에는 단기간에 폭발적으로 일어나는 단백질합성 때문에 생기는 대사부담으로 인해 외래단백질 생산능력이 제한될 수 밖에 없음을 알 수 있었다.
한편, 아세트산의 합성경로가 저해된 pta(phosphotransacetylase)결손 돌연변이균주를 만들어 외래단백질과 젖산(D-lactate)의 생산숙주로서의 능력을 평가하여 보았다. 아세트산은 고농도(5-10 g/L 이상)에서 대장균의 성장과 대장균에서의 외래단백질 생산을 저해하는, 대표적인 대사부산물로 알려져 있기 때문에 pta(-)돌연변이 대장균의 배양및 성장특성과 이 균주에서의 리파제 발현양상 등을 알아보았다. 탄소원으로 glucose, mannose 또는 glycerol을 포함한 M9 최소 배지에서, pta(-)돌연변이 대장균의 비성장속도는 정상균에 비해 약 30% 정도 감소됨이 관찰되었다. 이같은 성장저하현상은 acetate, malate, fumarate 또는 succinate 등과 같은 당신생대사(gluconeogenesis) 탄소원을 기질로 사용했을때는 나타나지 않았다. menadione에 의한 성장저해효과는 정상균주에 비해 pta(-)돌연변이 대장균에서 민감하게 나타났으며 특히, 글루코스 M9 최소배지를 사용할경우 그 효과가 두드러진 반면, 당신생대사 (gluconeogenesis) 탄소원을 기질로 사용하거나 Lactobacillus casei 유래의 젖산 생산효소(lactate dehydrogenase)를 이 돌연변이 대장균에 도입했을 때는 그 저해효과가 나타나지 않았다.
pta(-)돌연변이 대장균을 혐기적 환경에서 배양한결과, 세포내로 유입된 글루코스의 약 68%가 D-lactate로 전환되었다. 잠정적으로 유가배양법을 사용하여 10g/L의 세포 건물양으로 약 60 g/L의 D-lactate를 최종 생산할 수 있었다. 이 결과로부터 pta(-)돌연변이 대장균의 성장결손현상이 세포내의 산화환원수준과 연관되어 있음을 다시 한번 확인하였다.
한편, Pseudomonas fluorescens유래의 리파제를 이 돌연변이 대장균에서 발현시켰을때 정상균주에 필적할 만한 발현수율을 얻을 수 있었으며, 최종적으로 고농도배양기법을 이용하여, 기질공급속도의 정밀한 조절 없이도 75 g/L의 세포 건물양을 쉽게 얻을 수 있었다.
