For the production of extracellular carboxymethylcellulase(CMCase), fed-batch culture was carried out using a Bacillus megaterium transformed with a plasmid, pCK 108 harboring CMCase gene. It was observed that specific cellulase productivity of the cells was decreased significantly when high cell density(＞50 g/l) was achieved with continuous feeding of glucose or lactose as a carbon source. This phenomenon was more significant when glucose was used as a carbon source. As glucose feeding rate increased above 4g/hr, cell density was increased up to 77.1 g-DCW/l but yield of CMCase based on cell mass was lowed sharply. To find out the main reason, inhibitory metabolites accumulated in the culture broth were analyzed and identified using gas chromatography and HPLC. More than 10 kinds of organic acids were detected, including intermediates of TCA cycle, acetate, propionate, and isobutyrate etc. Among them propionic acid and isobutyric acid showed strong inhibitiory effect on both cell growth and CMCase production. Especially, isobutyric acid was found to inhibit CMCase production by 70% even at 10mM concentration. By reducing the inhibitory metabolites accumulation under slow feeding of lactose as a carbon source, cell growth and CMCase production could increase up to 55 g/l and 15.5 U/ml which were increased by 10 fold and 7 fold, respectively, comparing to the result obtained in batch culture. Lactose as a carbon source was found superior to glucose for CMCase production
섬유소 분해효소를 생산하는 유전자 재조합 균주인 Bacillus megaterium pCK108 을 이용하여 고농도 배양과 관련된 실험을 수행하였다.
우선 포도당을 기질로 한 회분식 배양에서 초기 포도당의 농도를 변화시켜준 결과 17시간만에 23.5g 의 세포 건조중량을 얻을 수 있었다. 이것은 포도당의 초기농도가 80g/l 일 때 성장지연시간(lag time)이 길어지는 단점과 10g/l 에서의 초기 포도당 농도일 때 세포의 건조 중량이 5.75g/l 의 적은 양이라는 단점을 극복한, 고농도 배양을 시작하기 위한 적합한 농도라고 판단되었다.
포도당을 이용하여 유가식 배양을 수행한 결과 배지공급 속도가 시간당 12g 일 때 세포의 최대 건조 중량이 77.1g 까지 증가하였다. 그러나, 섬유소 분해효소의 생산은 배지공급 속도가 시간당 2g 일 때 8.98 U/ml로 최대값을 나타내었다. 즉, 포도당의 공급속도 증가가 세포당 생성되는 섬유소 분해효소의 생산을 감소시키는 결과를 나타냈다. 이러한 저해현상의 주된 요인을 밝히기 위해서 고농도 발효액의 성분을 HPLC 로 분석한 결과 10종류 이상의 유기산이 검출되었다. 이들 중에서 대사 중간산물인 Succinic acid 등을 제외한 다른 유기산에 대하여 이들이 세포의 성장과 섬유소 분해 효소의 생산에 미치는 영향을 조사한 결과 Propionate 와 Isobutyrate 가 강력한 저해물질로 판명되었다. Propionate 의 경우 5mM 이상에서 섬유소 분해효소의 생산을 저해하고 20mM 이상에서는 세포 성장을 저해하였다. 특히, Isobutyrate의 경우 10mM 농도에서도 섬유소 분해효소의 생산을 70% 이상 저해하는 효과를 보였다. 유가식 배양에서 유기산의 변화치를 시간별로 측정한 결과 포도당의 배지 공급 속도가 증가할수록 Propionate 와 Isobutyrate의 생산량이 증가함을 보였다.
Lactose를 탄소원으로 하여 수행한 회분식과 유가식 배양에서 세포의 성장속도는 포도당을 사용한 경우보다 느리지만 섬유소 분해 효소의 생산량이 2배 이상 증가하였다. 시간당 2g으로 공급하는 유가식 배양으로부터 최대 세포 건조 중량이 46.7g/l 이었으며 최대 섬유소 분해효소의 생산량은 15.5 U/ml 로써 포도당 사용시보다. 효소의 생산량이 1.5-10배가 증가하였다. 또한 배지내에 유기산 저해물질들의 축적이 이루어지지 않게되어 포도당을 기질로 하는 발효공정에 비해 고농도 배양에 유리함을 확인하였다.
