To identify the polyhydroxyalcanoic acid(PHA) biosynthetic gene of Alcaligenes lactus, a genomic library was constructed and screened with two types of single stranded probes which were originated from both ends of open reading frames of phb CAB operon of A. eutrophus, a known bacterial strain producing PHA. In screening the PHA biosynthetic gene with plaque hybridization method, several positive clones were isolated with only probe 3' which corresponds to 3' end region of phb CAB operon(Reductase gene). These λPHA clones were confirmed to contain 5' region of PHA biosynthetic gene with chromosome walking and three λPHA clones(λPHA1,3,4) were selected. In the Sall/EcoRI fragment(7Kb) of λPHA 4 clone, there are four homology regions covering evenly among three genes(synthetase, thiolase, reductase) of phb CAB operon of A. eutrophus. As like phb CAB operon, three genes of PHA synthesis of A. lactus are clustered together and the nucleotide sequence homology between putative PHA operon of A. lactus and phb CAB operon of A. eutrophus is about 75% and that of amino acid sequence is 80 ∼ 85% But the arrangement of genes in putative operon is different from phb CAB operon in that putative PHA operon has extra sequence between phb A(thiolase gene) and phb B(reductase gene) which of size is 1.3 kb. This fragment shows no homology with any regions of phb CAB operon. Due to this reason Sall/EcoRI fragment(7kb) of λPHA 4 clone contains partial phb CAB operon lacks of 5' end region(2KB) but the orientation of λPHA 4 is antiparallel to λPHA 3 clone which has some overlapping region with λPHA 4 clone. So ultimately we got putative full operon of PHA biosynthetic gene encoding three enzymes of A. lactus.
알칼리젠네스 락투스(Alcaligenes lactus)에서 PHA 생합성 유전자를 탐색 및 분리하기 위하여 이미 대장균(Escherichia coli)에 클로닝된 알칼리젠네스 유트로포스 H16(Alcaligenes eutrophus H16) 유전자의 양끝을 탐침자로 사용하여 plaque hybridization 방법을 이용하여 탐색 및 분리하였다. 두 종류의 탐침자중에서 A. eutrophus의 phb CAB 오페론의 3'쪽에 있는 탐침자 3'(Probe 3')만이 양성 반응이 나왔으며 최종적으로 3개의 PHA clone(λPHA1,3, 4)을 얻었다. Southern blot analysis chromosome walking 방법을 사용하여 phbCAB 오페론의 5'쪽 방향과의 homology 탐색결과 Sall/EcoRI 제한효소 작용부위를 갖는 7KB 길이의 DNA 조각을 λPHA4로 부터 찾았으며, 이 부위의 염기 서열 분석결과 기존의 발견과 3개 유전자에 걸쳐서 4곳에서 homology를 갖는 것이 밝혀 졌다. 이때 염기서열유사성은 75%였으며, 아미노산 유사성은 80 ∼ 85% 에 달하였다. 특이한 점은 위의 7KB DNA조각들 중에 thiolase 와 reductase 중간의 약 1.3KB 크기의 DNA가 phbCAB operon의 어느곳과도 유사성이 관찰되지 않았다는 것이다. 7KB DNA 조각에는 phb synthase는 5'쪽의 2KB가 포함되어 있지 않으나, λPHA4의 방향이 λPHA3의 그것과 반대이므로 상호보완되는 관계로 λPHA3에 존재하므로, 본 실험을 통해 알칼리젠네스 락투스(Alcaligenes lactus)의 PHA생합성 유전자가 탐색 및 분리되었음을 밝힌다.
