The surface modification and the stabilities of antibody bound liposomes were investigated. Unsaturated PE, which does not formed stable bilayer at the physiological condition, was made stable bilayer through introducing $2.4\times10^{-4}$ molar ratio of the palmitoyl immunoglobulin G(p-IgG) into the lipid bilayer, and the formation of immunoliposomes was confirmed by the papain-induced lysis of calcein-entrapped immunoliposomes. The turbidity change and the release of calcein from liposomes were measured with the bile salts added to investigate the solubilization of liposomes. The solubilization of liposomes by bile salts depends upon the number of hydroxyl groups in the cholate. The solubilizing phenomena were significantly influenced by conjugated bile salts, and the number of hydroxyl groups in bile salts, but not by the configurational states of the hydroxyl group. Increase in hydrophobicity of bile salts resulted in the decrease of half-maximal concentrations for both absorbance and calcein release. The substitution of the head group with glycine or taurine decreased the calcein release, but the absorbance showed the different behavior. The stabilities of immunoliposomes incorporated with variable amounts of ganglioside $G_{M1}$, were investigated as a function of time and temperature. DOPE immunoliposome was destabilized within several hours, but the stabilities of liposomes were enhanced by the incorporation of ganglioside $G_{M1}$ into immunoliposome.
The size of liposomes prepared by REV method was increased as increasing the ratio of cholesterol to the lipid. But apparently the size does not seem to be sensitive to the Fab' coupled to the vesicle. As time elapsed, the turbidities of Fab' vesicle and MPB-PE vesicle did not change, but the turbidity of liposomes manufactured by sonication method had changed significantly. Such phenomena may be attributed to the disturbance of the bilayer characteristics.
The complex and physical characteristics of egg phosphatidylcholine(PC) liposome containing amphotericin B were investigated in terms of the size distribution, the calcein release, the turbidity, and the phase transition. The effective diameter of liposomes by dynamic light scattering was decreased from 450 nm to 220 nm as the amount of amphotericin B in liposomes was increased from 0 to 30 mol%. Bile salt-induced or natural leakage of calcein entrapped in amphotericin B-containing liposomes was lower than that of pure egg PC liposomes, indicating the intercalation of the drug into the bilayers. The turbidities of liposome suspension containing 5 and 10 mol% amphotericin B decreased at the low concentrations of deoxycholate(DOC) and significantly reduced at high concentrations, while the turbidities of pure PC liposome suspension slightly were increased and perfectly extincted at the corresponding low and high DOC concentrations, respectively. Calcein release and turbidity change of pure and amphotericin B-containing liposomes were explained by the second non-liposomal structure, amphotericin B-phospholipid complex. The phase transition temperatures of the complex with 5 mol% amphotericin B observed two peaks, amphotericin B would be partitioned into liposomes and amphotericin B-phospholipid complex.
The interaction of DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine) liposomes coated with palmitoyl lysozyme to fungal cells was investigated, using lysozyme as a stabilizer for an unstable bilayer and a recognizer for Candida albicans. Both lysozyme and palmitoyl-lysozyme(p-lysozyme) showed an antifungal activity, however p-lysozyme was more effective than native lysozyme. The minimal molar ratio of p-lysozyme to PE(phosphatidylethanolamine) for stable liposomes was $2.4\times10^{-4}$, and the optimal ratio was about $2.4\times10^{-3}$. P-lysozyme into the liposomal membrane was more effective against Candida albicans than free p-lysozyme, but their hemolytic activities show the similar pattern. The hemolytic ability of p-lysozyme into the PC liposome was lower than that of p-lysozyme into the PE liposome, and native lysozyme containing PC liposome was almost as toxic as lysozyme-coupled PC liposome. Palmitoyllysozyme-containing liposomal amphotericin B formulae was more effective to Candida albicans than free amphotericin B and liposomal amphotericin B.
In order to enhance the immune response of short peptides, peptides were coupled with liposomes. The coupling conditions of short synthetic peptides with liposomes were optimized, such as the coupling of peptide with liposomes depends upon the ratio of coupling agent to peptide, the ratio of peptide to lipid, and the liposome composition. Coupling was maximized when the ratio of glutaraldehyde to peptide, and the ratio of peptide to PE were 10, and 0.5, espectively. The PE composition in liposome was 0.25.
Noncovalent binding depends on the hydrophobicity of peptide and the fluidity of liposomal membrane. T-cell epitope bounds more effectively to liposome than B-cell epitope does. The polarization of liposome membrane with T-cell epitope was enhanced. T-cell epitope of HBsAg was more hydrophobic than B-cell epitope. In case of coupled peptide to liposomes, the polarization of membrane coupled to peptide showed a similar pattern to that of liposome embedded peptide.
Liposomes have been found to significantly enhance the immune response against entrapped HBsAg. The immune response against HBsAg after 2 weeks from second booster revealed that the relative potencies of the adjuvants were in order of CFA ＞ liposomal adjuvant ＞ liposome ＞ alum. The immune response against the synthetic peptides was slightly enhanced by the incorporation of lipid A or G$_{M1}$.
약, 효소, 단백질 및 항원등 생리활성적으로 유용한 물질의 전달체로 널리 연구되고있는 리포좀을 적중화시키거나 항원의 운반체로 사용하기 위하여 리포좀의 표면을 항원이나 항체, 단백질로 수식시키는 연구와 수식된 리포좀의 안정성및 특성에 관한 연구를 수행하였다.
인지질 소포체를 구성하는 물질로는 EPC(egg york phosphatidylcholine), DPPC(depalmitoyl PC), DSPC(distearoyl PC), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)와 sphingomyelin이 사용되었다. 생체 계면활성물질인 담즙산염이 항체를 포함한 리포좀의 상전이 및 안정성에 미치는 영향과 안정성을 향상시키는 연구를 수행하였으며, 항진균제로 사용되고있는 amphotericin B의 독성을 감소시키고 진균세포에 대한 활성을 증가시키기 위하여 리포좀의 표면을 lysozyme으로 수식하여 그 특성을 연구하였다. 또한 짧은 합성 펩타이드를 항원으로 사용하여 백신을 제조할 때 생기는 낮은 면역원성의 문제를 해결하기 위하여 펩타이드를 운반체에 결합시켜 사용하게되는데, 합성 펩타이드 백신의 운반체로써의 리포좀의 가능성을 연구하였다.
1. 항체가 결합된 리포좀
항체를 이용한 리포좀의 수식은 비공유결합 (삽입)과 공유결합, 두가지 방법으로 수행하였다. Target-sensitive 리포좀을 제조하기 위하여 비공유결합을 사용하였으며, 항체의 비율이 $2.5\times10^{-4}$ 일 경우에 리포좀이 형성되었고, 항체에의한 리포좀의 형성은 효소분해 실험을 통해서 확인하였다. 항체를 포함한 리포좀의 담즙산염에 의한 가용화를 흡광도와 형광물질의 방출등으로 연구하였는데, 리포좀의 가용화는 담즙산염의 수산기 갯수와 수산기의 배향, 기능기에 영향을 받는데 일반적으로 소수성이 높은 담즙산염이 가용화 능력이 높은 것으로 나타났으나, 기능기가 결합된 담즙산염의 경우에는 그 기능기에 따라 경향성이 다르게 나타났다. 항체만으로 수식된 리포좀의 경우 안전성이 매우 낮은데 비해 ganglioside가 첨가된 리포좀의 경우 안정한 것으로 나타나는데, 이는 ganglioside가 리포좀 막에 삽입된 항체를 잡아주는 역할을 하기 때문으로 생각된다. REV(reverse phase evaporated vesicles) 방법으로 제조된 리포좀의 경우, 크기는 첨가되는 콜레스테롤의 비에 따라 크기가 증가하였으며, 항체의 결합여부에 따라서는 큰 차이가 없었고, 항체가 결합된 리포좀의 경우에 시간에 지남에 따라서도 매우 안정한 것으로 나타났다.
2. Amphotericin B가 함유된 리포좀
항진균제로 널리 사용되고있는 amphotericin B를 리포좀에 포함시켜 독성을 감소시키거나, 진균세포와 선택적으로 결합함으로 그 약효를 증가시키는 방법을 연구하였다. Amphotericin B가 포함된 PC 리포좀의 경우, 첨가되는 amphotericin B의 양이 증가할수록 리포좀의 크기는 감소하며, 약-인지질 복합체의 형성이 증가한다. Amphotericin B가 리포좀에 첨가되면 리포좀상과 인지질-약 복합체상으로 분배가 일어나는데 이는 DSC상에서 두개의 peak로 확인되었다. 리포좀에 함유된 amphotericin B를 유리 amphotericin B와 비교해보면, 유리 amphotericin B와 항진균성은 유사하면서 독성은 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다. 진균세포에 대한 선택성을 부가하기 위하여 진균세포의 세포벽에 존재하는 chitin과 선택성을 갖는 lysozyme을 리포좀 제조에 도입하였다. 우선 lysozyme 에 소수성 지지대를 부가하여 리포좀 막으로의 삽입을 용이하게 하였으며, $2.3\times10^{-3}$ 비일 때 리포좀이 가장 잘 형성되었다. 수식된 lysozyme(p-lysozyme)은 항진균 활성을 나타냈으나, 고농도, 장기간 항온시 독성을 나타내는 것으로 관측되었다. p-lysozyme을 피로좀에 삽입시키면 PC 리포좀인 경우에는 독성이 감소하였으나 PE 리포좀인 경우에는 독성의 감소가 관측되지 않았다. 그러나 이러한 문제는 lysozyme을 PC의 표면에 공유결합시킴으로 극복할 수 있으며, 리포좀의 표면에 공유결합된 lysozyme은 독성이 감소되고 항진균성도 나타난다. Lysozyme이 함유된 리포좀에 amphotericin B를 첨가시키면 약간의 독성을 나타내지만, 유리 amphotericin B에 비하면 낮은 정도이고, 항진균성은 리포좀에 amphotericin B가 포함된 경우보다 증가되는 것으로 나타났다. 즉, lysozyme이 첨가됨으로 인하여 amphotericin B의 항진균효과를 향상시키는 효과를 나타내었는데 이는 lysozyme자체의 항진균성과의 상승작용에 의한 것이다.
3. 백신 운반체로써의 리포좀
합성 펩타이드의 항원성을 향상시키기 위해서 리포좀에 펩타이드를 결합시켜서 사용하는데, 결합효율을 최대화하기 위한 조건들을 확립하였고, 결합된 펩타이드를 면역화시킬 경우, 항체생성을 증가시키기 위한 리포좀의 조성을 조사하였으며, 운반체로써의 리포좀의 가능성을 다른 보조체와 비교하여 연구하였다. 펩타이드를 리포좀에 결합시키기기 위해 사용되는 결합시약과 펩타이드의 비율과 펩타이드와 리포좀의 결합기인 PE와의 비율, 리포좀 내에 존재하는 PE/PC의 비율 등을 변화시키면서 결합효율을 연구하여 최적조건을 확립하였다. 항체 생성에 미치는 리포좀 성분의 영향은 리포좀을 구성하는 인지질의 종류, 즉, 상전이 온도에 따른 인지질의 종류와 B-cell 증식인자로 알려진 lipid A, 지라로의 적중화에 작용한다고 알려진 ganglioside를 첨가하여 항체 생성 정도를 확인하였다. B형 간염 바이러스의 표면 항원의 일부인 pre-S2 부분중 130-145번 잔기부위를 합성하여 사용하였는데, 이 펩타이드의 경우, 상전이 온도가 높은 인지질을 사용할 경우 항체생성 정도가 증가하는 것으로 나타났으며, lipid A나 ganglioside가 첨가된 경우에도 항체 생성이 증가하였다. B형 간염 바이러스의 표면 항원의 일부인 pre-S2 부분중 130-145번 잔기부위(B-cell epitope)와 159-174번 잔기부위(T-cell epitope)의 소수성도를 측정하여보면, T-cell epitope부위로 알려진 부분이 더 소수성을 띠고 있었으며, 리포좀 막으로의 분배가 잘 일어남을 알 수 있었다. B형 간염 바이러스의 표면 항원 (HBsAg) 전체 단백질을 사용하여 항체생성 정도를 여러 보조체와 리포좀을 비교하였다. 모든 경우의 보조체가 유리 HBsAg를 사용하는 경우보다 항체 생성을 크게 증가시켰으며, 항체생성정도를 비교해보면, CFA ＞ 리포좀을 침적시킨 alum ＞ 리포좀 ＞ alum 의 순으로 나타났다. 현재 인체에는 alum만을 보조체로 사용할 수 있는데, 리포좀은 실험적으로 인체에 사용되고 있는 보조체로 alim보다 그 효과가 높게 나타나므로 사용 가능성이 기대된다.
