It has been proposed (Randall and Hardy, 1986) that export of protein involves a kinetic partitioning between the pathway that leads to productive export and the pathway that leads to the folding of polypeptides into a stable conformation that is incompatible with export. As predicted from this model, a decrease in the rate of export of RBP to the periplasmic space of E.coli resulting from a defect in the leader sequence was partially overcome by a mutation that slowed the folding of the precursor, thereby increasing the time in which the polypeptide was competent for export (Teschke et al., 1991). However, this model considered only the refolding side of the folding kinetics.
The mutants, containing Tyr substitutions at residues 32, 115, and 261, with altered folding rate and stability have been characterized (Kim and Park, 1993; Kim et al., submitted). In this study, we made a combination between the signal sequence mutation (rbsB103) and one of the Tyr substitutions, i.e. FYF, FYY, YFY, YFF, and YYF. In pulse-chase experiment for the rccombinants, both rbsB103-FYF and rbsB103-FYY showed an increase in protein translocation, 20 and 14%, respectively, compared to 4-6% of rbsB103 alone. However, other combinations (rbsB103-YYF, rbsB103-YYF, rbsB103-YFY) were the same as rbsB103-YYY. This result is consistent with the notion that there exists a correlation between translocation efficiency and equilibrium free energy of folding, providing a new implication on the regulation of protein unfolding in membrane translocation.
대장균의 리보스 결합단백질(ribose-binding protein, RBP)은 생체막을 통과하기 위해 신호배열이 필요하며, 여기에 도입된 돌연변이 rbsB(-17)LP는 RBP의 생체막전위를 억제한다(Iida et al., 1985, EMBO J., 4: 1875). 이 rbsB103와 Tyr 잔기가 치환된 folding 돌연변이(Kim and Park, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 1237)의 숙성체 부위를 재조합시켰다. 이들 돌연변이는 야생형이 가진 세개의 tyrosine들(32, 115, 261 잔기에 위치함)중 한개 내지 두개가 phenylalanine으로 치환된 것으로서 이하에 약어 (야생형의 경우, YYY)로 표시하였다. 이들 재조합체 (rbsB103-FYF외 4가지)에 대한 주화성 실험을 수행한 결과, rbsB103-FYF만이 리보스에 대한 주화성을 나타내었다. 또한 이들 재조합체에 대한 펄스 표지 실험 결과, rbsB103-FYF와 rbsB103-FYY는 각각 20, 14%로서 막전위 효율의 증가를 보였고 나머지 재조합체들(rbsB103-YFY, rbsB103-YFF, rbsB103-YYF)의 경우는 rbsB103와 비슷한 4-6%수준으로 막전위 효율의 양상을 보이지 않았다. 이들 재조합체와 유전적 방벗에 의해 분리된 회복돌연변이 rbsB A27T, rbsB V50E(Teschke et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 11789)의 막전위 정도와 단백질의 평형 자유에너지를 종합적으로 분석한 결과, 그 값이 작을수록 rbsB103에 대한 막전위 회복정도가 증가됨이 관찰되었다.
